检测猪乙脑抗体的EDⅢ抗原间接ELISA与血凝抑制和蚀斑减少中和试验的相关性研究

【摘要】日本脑炎(Japaneseencephalitis,JE)又称流行性乙型脑炎,简称乙脑,是一种经蚊子传播的,由黄病毒科黄病毒属的日本脑炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV)引起的人畜共患病。人和马的乙型脑炎临床特征是发热和脑炎,猪乙型脑炎主要表现为母猪流产和公猪睾丸炎。猪感染JEV后病毒血症持续时间长,滴度高,是JEV在自然界的扩增宿主。目前没有针对JE治疗的特效药,预防性疫苗接种是防控该病的主要措施之一。因此,对JEV易感动物群体的免疫状态及时有效的监测就显得十分重要。JEV囊膜蛋白(EnvelopeProtein,E)结构域Ⅲ(DomainⅢ,EDⅢ)是JEV主要结构蛋白E蛋白上的抗原结构域,能激发机体产生病毒特异性的体液免疫,在宿主抗JEV感染致病中起重要作用。血凝抑制试验(HemagglutinationInhibitiontest,HI)和蚀斑减少中和试验(PlaqueReductionNeutralizationTest,PRNT)是检测JEV抗体的经典方法。但是因为这些检测方法对试验材料、操作者的熟练度和特殊设备的依赖而在临床的广泛应用受到限制,酶联免疫吸附试验(ELISA)是目前检验常用的免疫学检测方法之一,主要因为其操作简单,检测快速,敏感性、特异性强,检测量大。但是ELISA检测结果的临床意义评价需要大量相关流行病学数据来支持。因此,本研究在实验室前期研究的基础上对检测JEV抗体的间接ELISA检测方法进行完善,对比检测临床血清样品,分析间接ELISA结果与HI以及PRNT检测结果的相关性,从而为建立JEVEDIII抗原间接ELISA提供临床意义的评价指标,为JEV抗体ELISA试剂盒的研制奠定基础。具体研究内容如下：1.原核表达乙脑病毒EDIII抗原进行间接ELISA的研究本试验室构建保存的pET-28a-EDⅢ勺BL21甘油菌,经表达条件优化,EDIII蛋白在大肠杆菌中IPTG低温诱导,呈可溶性表达,但是表达量低；37℃诱导表达EDIII可呈包涵体表达,以包涵体形式大量存在。通过His标签亲和层析柱分离纯化,得到较纯的EDIII蛋白,经三次表达纯化,测得平均蛋白浓度为2.84mg/mL,平均每升菌液可得9.4mg纯化的蛋白。用Westenblot分析所表达的蛋白可以与JEV阳性抗体特异性反应,表明包涵体表达的EDIII蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原。用纯化的EDIII蛋白作为包被抗原,对各项反应条件进行优化,建立了检测JEV抗体的间接ELISA方法。确定ELISA的最佳反应条件如下,包被浓度0.7μg/mL,4℃过夜;1%BSA的PBST4℃封闭过夜；待检血清稀释度为1：40,37℃作用1h；二抗1:5000(0.2μg/mL)稀释,37℃作用1h。阴阳性判断,以OD450nm≥0.436判定为阳性,OD450nm≤0.363为阴性,中间值为可疑,复检仍为可疑值时判定为阴性,即OD450nm<0.436即判定为阴性。通过特异性试验表明与蓝耳病,猪瘟,伪狂犬病等的阳性血清OD45nm值低,无交叉反应。批间和批内重复性试验效果较好。此方法具有良好的特异性、重复性和敏感性。2.乙脑病毒EDⅢ抗原间接ELISA与血凝抑制及蚀斑减少中和试验的相关性研究用间接ELISA检测127份猪血清中JEV抗体,再对其进行HI效价测定,最后对其中21份进行PRNT,以测定其中和效价。经配对卡方检验表明,HI对ELISA的灵敏度为72.5%,特异度为52%,两种方法的符合率为68.5%,两种检测方法差异不显著(x2=5.535,P=0.17>0.05)；PRNT对HI试验的灵敏度为72.2%,特异度为33.3%,两种方法判定的符合率为66.7%,差异性不显著(X2=0.039,P=0.453>0.05);PRNT对ELISA的敏感度为80.0%,特异度为50.0%,两种方法判定的符合率为71.4%,差异不显著(x2=1.890,P=1>0.05)。说明此三种检测方法都能有效检测猪血清中的乙脑抗体水平,但是ELISA检测更为敏感。3.猪血清乙脑抗体的流行病学调查为更好地了解不同免疫背景的猪血清中乙脑抗体水平,用建立的乙脑病毒EDIII抗原间接ELISA方法,对339份不同乙脑疫苗免疫的猪血清,以及安徽、江苏不同规模猪场采集的不同免疫背景的猪血清进行检测分析。并对不同地区、不同规模猪场以及不同免疫程序的猪血清中乙脑抗体流行情况进行分析。结果表明,乙脑抗体流行按照猪场所在地区、猪场规模化程度以及免疫程序,呈现一定的规律性；其次也表明所建立的EDIII抗原间接ELISA能真实反应乙脑抗体水平,为后续乙脑抗体检测试剂盒的研制提供了较详实可靠的依据。
【作者】金悦新；
【导师】曹瑞兵；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】乙脑；血凝抑制试验；蚀斑减少中和试验；酶联免疫吸附试验；相关性；

【参考文献】
[1]赵志刚.大连海域底泥环境多溴联苯醚生态风险分析研究[D].大连海事大学,环境工程,2013,硕士.
[2]于艺.KiSS-1基因及MMP-9在卵巢上皮性癌中的表达及意义[D].中国医科大学,妇产科学,2004,硕士.
[3]郭丰梅.用于药物包衣材料的水性肠溶型聚丙烯酸树脂的合成和研究[D].齐鲁工业大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[4]柴剑丽,吴春燕,王文娟,应迎娟,蒋欣欣,熊晓玲.糖尿病肾病患者血液透析中低血糖管理的持续质量改进[J].中华护理杂志,2015,02:170-174.
[5]周丽萍.园区薄弱初中语文课堂有效教学研究[D].苏州大学,教育（专业学位）,2014,硕士.
[6]邱烨.基于职业发展理论的高校学生社团建设研究[D].扬州大学,教育经济与管理,2011,硕士.
[7]李明.论中国水墨画笔法在当代水彩画中的运用[D].广东工业大学,设计学,2013,硕士.
[8]于佳.MV公司人力资源培训案例研究[D].大连理工大学,MBA（专业学位）,2013,硕士.
[9]肖睿.北京地铁15号线无线通信系统总承包项目施工质量控制[D].西南交通大学,项目管理,2013,硕士.
[10]杜梦乡.《小孙屠》词汇研究[D].四川外国语大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[11]鲍传友.关于我国高校学分制实施过程中存在的问题研究[D].辽宁师范大学,课程与教学论,2003,硕士.
[12]薛亚茹,唐欢欢,陈小宏.高阶高分辨率Radon变换地震数据重建方法[J].石油地球物理勘探,2014,01:95-100+131+303.
[13]张绍杰,胡寿松.基于反馈线性化的MIMO非最小相位系统指数镇定[J].控制与决策,2009,02:301-304.
[14]刘建东.基于Web的日志挖掘技术的研究[D].哈尔滨工程大学,2003.
[15]于汪洋.服务型政府视域下我国电子政务建设研究[D].内蒙古大学,行政管理,2013,硕士.
[16]李海波.碳及碳基复合材料的合成、表征与性能研究[D].中国科学技术大学,2010.
[17]王新,赵强.不完全数据库中的关联规则挖掘[J].云南民族大学学报(自然科学版),2005,03:252-254+258.
[18]李武.面向现代服务业的大规模分布式文件存储系统设计和实现[D].浙江大学,2008.
[19]包辉,熊爱明,赵荣祥.PC钢棒热处理生产线自动控制系统[J].冶金自动化,2002,06:51-53.
[20]胡鹏.论当前我国私募基金的规范与监管问题[D].河南大学,国民经济学,2004,硕士.
[21]张洪刚.煤沥青基泡沫炭的结构控制及其复合增强[D].华东理工大学,化学工艺,2014,硕士.
[22]王露.基于OpenFlight模型的红外仿真技术研究[D].燕山大学,系统工程,2014,硕士.
[23]王根岭.行人检测与跟踪中若干关键技术的研究[D].浙江理工大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[24]黄澍庄.频繁项集挖掘算法分析与比较[J].德州学院学报(自然科学版),2005,06:65-71.
[25]董菲.从翻译适应选择论看林译《迦茵小传》[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[26]张进宝.社会资本视角下的大学生创业研究[D].南京师范大学,社会学,2012,硕士.
[27]潘越,戴亦一,吴超鹏,刘建亮.社会资本、政治关系与公司投资决策[J].经济研究,2009,11:82-94.
[28]高巧巧.CBI（内容依托教学）理念下人教版《新高中英语》教材的内部评价[D].西安外国语大学,课程与教学论,2013,硕士.
[29]成璇.西安历史文化产业竞争力提升策略研究[D].长安大学,产业经济学,2013,硕士.
[30]朱军.国际工程承包合同及其争议预防和解决[D].华东政法学院,法律,2003,硕士.
[31]王群芳.平面张弦结构的优化设计及动力性能分析[D].山东建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[32]张冬梅,王辛刚,高雪芬.高等数学教学渗透研究性学习的研究与实践[J].大学数学,2014,S1:69-72.
[33]胡琛,唐晓波.数据仓库技术在配电线路电量管理系统中的应用[J].电力需求侧管理,2004,02:22-25.
[34]王莉.农产品贸易保护及其影响因素的实证研究[D].浙江工业大学,2009.
[35]刘婉明.日本留学与创造社作家的国家想象[D].南京大学,中国现当代文学,2012,博士.
[36]陈振新.精益生产在Y汽车零部件企业的应用研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[37]李荣钧.模糊决策的基础——模糊集比较与排序[J].控制与决策,2003,02:221-224.
[38]王如祥.蒙西电网黑启动方案研究[D].华北电力大学（河北）,电气工程,2004,硕士.
[39]李小艳.褐煤管式气流干燥流场的数值模拟研究及干燥管结构优化[D].辽宁工程技术大学,热能工程,2012,硕士.
[40]孔金娥.用真实的人生书写人生的真实[D].华中师范大学,学科教学,2011,硕士.
[41]汪莹.转基因大麦及棉花的非预期效应研究[D].东北大学,生态学,2011,硕士.
[42]张恺.上流式厌氧污泥床反应器流态模拟研究[D].东华大学,环境工程（专业学位）,2014,硕士.
[43]汪庆喜.Co、Zn、Al掺杂对多铁材料铁酸镓结构及性能的影响[D].中国矿业大学,凝聚态物理,2014,硕士.
[44]王若愚.政府财政行为与劳动收入占比[D].重庆大学,金融学,2014,硕士.
[45]劉剛.晉系文字的範圍及內部差異研究[D].复旦大学,漢語言文字學,2013,博士.
[46]江磊.线粒体DNA中D-Loop突变在非小细胞肺癌中的意义[D].蚌埠医学院,外科学,2013,硕士.
[47]李培署,王广凯.城市有轨电车用微机控制直通电空制动系统研制[J].现代城市轨道交通.2005(02)
[48]白峭峰.基于强力旋压的翻边轴瓦反求分析[D].中北大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[49]陈彦瑞.汉语平面公益广告中多模态隐喻的认知研究[D].中国海洋大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[50]包红梅.禽流感病毒RT-LAMP系列检测方法的建立和应用[D].东北农业大学,预防兽医,2014,博士.