多杀性巴氏杆菌OmpH与溶血性曼氏杆菌lktA蛋白的融合表达与免疫原性研究

【摘要】牛呼吸道疾病综合症（Bovinerespiratorydiseasecomplex，BRDC）是牛的一种急性呼吸道疾病，目前国内外学者普遍认为它是由于环境的突然变化、应激、运输等多种因素引发的，每年给养牛业带来巨大损失。多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）和溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica）是引起牛呼吸道疾病综合症（BRDC）的重要病原，还可引起牛的出血性败血症（HaemorrhagicSepticaemia）和纤维素性肺炎（Fibrinouspneumonia），给养牛业带来巨大损失。临床抗生素的滥用使得耐药菌株不断的出现，给临床治疗带来巨大困难。因此，疫苗接种有望成为预防和控制这两种病原感染的主要措施。研究表明OmpH是多杀性巴氏杆菌最主要的免疫原，可以刺激机体产生保护性抗体，能抵抗病原菌的挑战，白细胞毒素（LKT）是溶血性曼氏杆菌最重要的毒力因子，LKT的多克隆抗体能够对同源的其他血清型提供交叉保护。本研究拟通过大肠杆菌表达系统表达出具有生物学活性的M.haemolytica白细胞毒素蛋白（lktA）及lktA与P.multocidaOmpH的重组融合蛋白（lktA-OmpH），分别构建既能调节天然免疫，还能诱导获得性免疫的亚单位疫苗，通过实验研究分析融合蛋白lktA-OmpH与OmpH蛋白和lktA蛋白三者所激发和诱导的天然免疫应答与获得性免疫应答规律，以及各个蛋白对小鼠的免疫保护作用之间存在的差异，以论证融合蛋白lktA-OmpH是否具有既能抵抗多杀性巴氏杆菌又能抵抗溶血性曼氏杆菌的双重挑战，为牛呼吸道疾病综合症新型亚单位疫苗的研制提供新认识和新途径。首先，通过PCR的方法扩增溶血性曼氏杆菌（Mannheimiahaemolytica）的白细胞毒素合成基因lktA，扩增后连接到pMD18-T载体上，经双酶切和测序鉴定正确后克隆到pET28-a表达载体上，转化入大肠杆菌感受态BL-21(DE3)PlyS中，经IPTG诱导后，SDS-PAGE鉴定蛋白的表达及其生物学活性。其次，通过overlapPCR基因融合技术扩增融合基因lktA-OmpH，鉴定正确后克隆到表达载体pET28-a，转化到感受态BL-21(DE3)PLYS进行诱导表达，利用镍柱纯化技术纯化lktA蛋白和融合蛋白lktA-OmpH，并检测两种蛋白的生物学活性。最后，通过以小鼠作为动物模型，检测免疫小鼠后血清中的抗体、淋巴细胞增殖情况、INF-γ分泌状态以及细胞因子IL-4的含量，最后用溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌分别攻毒，进而评估融合蛋白与单个蛋白的免疫保护效果。结果，成功构建具有生物学活性的lktA蛋白和融合蛋白lktA-OmpH。小鼠实验结果表明，与对照组PBS相比，OmpH蛋白+佐剂组、lktA蛋白+佐剂组和lktA-OmpH+佐剂组的抗体消长曲线明显，差异显著（P<0.05），而lktA-OmpH组和对照组PBS抗体消长不明显。三免后两周小鼠淋巴细胞增殖、血清中细胞因子IL-4的含量及INF-γ分泌量，lktA-OmpH+佐剂组、lktA蛋白+佐剂组和lktA-OmpH+佐剂组比对照组PBS和lktA-OmpH组有明显的提高，差异显著（P<0.05），与血清中抗体校长曲线相一致。攻毒结果表明，溶血性曼氏杆菌攻毒组lktA-OmpH+佐剂组、lktA蛋白+佐剂组、lktA-OmpH及PBS组的保护率分别为80％、80％、50％、0％；多杀性巴氏杆菌攻毒组lktA-OmpH+佐剂组、OmpH+佐剂、lktA-OmpH和PBS组的保护率分别为70％、80％、50％、0％。综上所述，本实验所构建的融合蛋白lktA-OmpH具有一定生物学活性，能够产生针对lktA-OmpH的特异性抗体，并且能够一定程度上抵抗溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的攻击，为研制高效奶牛牛呼吸道疾病综合症疫苗提供了一定的参考。
【作者】高佳滨；
【导师】朱战波；
【作者基本信息】黑龙江八一农垦大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】牛呼吸道疾病综合症；溶血性曼氏杆菌；多杀性巴氏杆菌；lktA蛋白；融合蛋白；疫苗；

【参考文献】
[1]郑湘萍.论当代社会正义感的缺失及其培育[D].湖南师范大学,伦理学,2004,硕士.
[2]代颖.社区服务中心建设项目策划[D].华中师范大学,社会工作,2013,硕士.
[3]冯欣.广东省高等职业院校学生学习策略水平的研究[D].广东技术师范学院,职业技术教育学,2013,硕士.
[4]张婷婷.小麦蛋白质二硫键异构酶的表达与性质研究及其对面粉品质的影响[D].华南理工大学,制糖工程,2014,硕士.
[5]陈浩.三大种群蛋白质内部重复片段组成规律的比较研究[D].浙江大学,2004.
[6]李嘉.健脾活血祛湿方对肝硬化腹水大鼠肝AQP8、9和线粒体的影响[D].广州中医药大学,中医内科学,2014,博士.
[7]申屠南凯,司新辉,许磊.铝带热连轧防止带材与张力辊打滑方法研究[J].冶金自动化.
[8]冯娟.从动态对等的视角看英译汉中的词类转译[D].湖南师范大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[9]卢军,匡庐芳,何录华,付建华,张掖市建设局招标管理办公室,陆军,江苏省化工建设工程质量监督站,高子正,原天津国际招标公司,葛天平,南通市政府采购中心.互动话题(三)[J].机电信息.2008(02)
[10]高锐.黄连饮片中小檗碱的提取与重金属去除工艺的研究[D].安徽农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[11]贺珊.新世纪军旅文学影视化现象研究[D].湖北民族学院,文艺学,2013,硕士.
[12]潘四平.不同杂交稻组合腋芽再生特性的比较研究[D].湖南农业大学,种植,2003,硕士.
[13]马珂佳.甜玉米混汁加工技术研究[D].河南农业大学,食品科学,2012,硕士.
[14]王意锟,金爱武,朱强根,邱永华,季新良,张四海.施肥对毛竹种群不同年龄分株间胸径大小关系的影响[J].植物生态学报,2014,03:289-297.
[15]张潇艺.侵犯财产罪保护法益案例分析研究[D].兰州大学,法学,2012,硕士.
[16]胡斌斌.视频语义信息提取的研究[D].浙江工业大学,2009.
[17]徐华清.煤矿区蒙古黄芪恢复种植选种育苗技术研究[D].西南大学,森林培育,2014,硕士.
[18]刘利丹,介冬梅,刘洪妍,郭梅娥,李楠楠.东北地区芦苇植硅体的变化特征[J].植物生态学报,2013,09:861-871.
[19]刘彬.骨髓间充质干细胞膜片层的体外构建及成骨分化实验研究[D].遵义医学院,外科学,2014,硕士.
[20]高峰.压电陶瓷器件在球磨机喂料自调系统中的应用[J].冶金自动化,1984,03:41-44.
[21]徐玉莲.补气增液汤治疗功能性便秘（气阴两虚型）的临床研究[D].广州中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[22]闫雨.青州市农村中小学音乐教育现状调查与研究[D].曲阜师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[23]谭文志.基于TTCN-3的AUTOSAR一致性测试研究[D].湖南大学,计算机科学与技术,2011,硕士.
[24]褚洪涛.网络文化建设和管理研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[25]赵钰.十四味融结汤对乳腺增生模型大鼠血清中雌二醇及孕酮含量的干预研究[D].河南中医学院,中医临床基础,2013,硕士.
[26]彭静祎.无中微子末态的双β衰变及其新物理模型研究[D].华中师范大学,理论物理,2014,硕士.
[27]郝颖.动力调谐陀螺仪的关键技术研究[D].哈尔滨工程大学,2006.
[28]张明.基于改进动态神经网络的股票预测模型的研究[D].内蒙古大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[29]許詩萌.近代中日語彙交流から見る中国語訳語の比較研究――『天演論』と『進化論与倫理学』を中心に[D].西安外国语大学,日语语言文学,2014,硕士.
[30]赵梓月.论行政给付中的信赖保护原则[D].黑龙江大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[31]戚威.基于复杂网络的购物篮商品网络分析研究[D].江苏科技大学,工业工程（专业学位）,2014,硕士.
[32]贾慧星,章毓晋.基于梯度方向直方图特征的多核跟踪[J].自动化学报,2009,10:1283-1289.
[33]陈一航.提升地方政府环境治理能力面临的挑战及其对策研究[D].湖南师范大学,行政管理,2013,硕士.
[34]潘立.基于人椅系统三向振动的汽车平顺性建模与仿真[D].浙江工业大学,2004.
[35]王文江.黑曲霉发酵法制备山杏多肽及其生物活性的研究[D].北京林业大学,农产品加工及贮藏工程,2013,硕士.
[36]陈根军,顾全.基于CIM的配电网一体化追踪拓扑[J].电力系统自动化,2009,03:59-63.
[37]曾铁钢.基于路由器的分布式存储技术的研究[D].复旦大学,计算机应用技术,2012,硕士.
[38]赵文平.电子商务下企业CRM的实施研究[J].西安电子科技大学学报(社会科学版),2003,02:60-64.
[39]姚群峰.移动运营商定制终端的研究[J].世界电信.2004(04)
[40]谢九梅.北京市大学生绿色消费意识与行为模式研究[D].首都经济贸易大学,企业管理,2014,硕士.
[41]周昱.肝动脉导管栓塞新辅助化疗大肠癌肝转移的临床分析[D].苏州大学,外科学,2013,硕士.
[42]范瑞锋.光纤动态解脱力测试系统研究[D].西安工业大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[43]黄长武.多重耐药鲍曼不动杆菌整合子分型及流行病学研究[D].西南大学,微生物学,2014,硕士.
[44]杭菲.江苏省农村合作金融机构的效率研究[D].南京农业大学,金融学,2012,硕士.
[45]闫斌,周小佳,王厚军,郎方年,李本亮.一种基于地理位置信息的高能效无线传感器网络[J].自动化学报,2008,07:743-751.
[46]徐登辉.超薄层在有机电致发光器件中的应用[D].北京交通大学,2007.
[47]杨科.中信戴卡股份有限公司采购管理研究[D].燕山大学,工商管理,2014,硕士.
[48]席佩涛,刘泽,段晗晗,卢迎飞.基于数字锁相放大算法的电磁传感器探伤研究[J].传感器与微系统,2015,01:54-56+59.
[49]王照蒸.密云水库上游土地利用方式对地表水非点源污染的影响[D].首都师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[50]董芸芳.双吲哚，β-氨基酮及硫醚类化合物的合成和生物活性研究[D].河北大学,药物化学,2014,硕士.