鸭卵黄囊膜IgY Fc受体基因的克隆与表达研究

鸭卵黄囊膜IgY Fc受体基因的克隆与表达研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-09-15 分类:硕士论文 喜欢:2569
师大云端图书馆

【摘要】鸭母源抗体能够通过卵黄囊垂直传播至刚孵化的雏鸭,发挥免疫应答功能。其中IgY的含量最为丰富。我们推测鸭卵黄囊膜上存在能够转运IgY的受体。对哺乳动物FcRn和鸡FcRy特性的研究,发现两种受体结合抗体均具有pH依赖性,即在酸性条件下与抗体结合,中性或碱性条件下解离,籍此机制将母源抗体特异性转运至新生动物体内。而鸭IgY被转运至雏鸭体内的过程与此类似,但目前没有关于鸭卵黄囊膜FcRy的相关报道,故对此展开研究。本研究的主要内容如下:1.鸭FcRy的分离纯化采用辛酸-硫酸铵法和水溶稀释法,从鸭蛋黄中粗提卵黄IgY,纯化获得了鸭完整型IgY,其重链约67KDa,轻链约25KDa。进一步制备鸭IgY-亲和层析柱,通过调节不同pH值,从鸭卵黄囊膜分离纯化获得了鸭FcRy,其大小约为180KDa。2.鸭FcRy全长基因的克隆与序列分析从24-25日龄鸭胚中剥离卵黄囊膜,提取总RNA,经过RT-PCR分5段扩增编码鸭FcRy的基因片段,将5个目的基因片段分别连接至pMD18-T载体后测序,拼接获得了鸭FcRy全长基因,大小为6293bp,与已报道的鸭磷脂酶A2受体基因核苷酸同源性为99%。3.鸭FcRy-CF的亚克隆、表达及纯化利用PCR方法亚克隆FcRyN-端富含半胱氨酸域-纤维连接蛋白Ⅱ型域(FcRy-CF)基因片段,构建重组质粒pGEX-KG-CF和pET-32a-CF,分别在大肠杆菌中进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果显示,分别在约39KDa和33KDa处出现蛋白条带,与预测的融合蛋白大小相符。并对这两种蛋白进行纯化,均得到较单一的目的蛋白。4.兔抗鸭FcRy多克隆抗体的制备、纯化与鉴定利用纯化的融合蛋白His-CF作为免疫原免疫家兔,成功制备了兔抗鸭FcRy高免血清,用间接ELISA法检测其血清抗体效价高达1:16000,并采用抗原亲和层析法对所获得的高免血清进行了纯化。经Westernblot鉴定该多克隆抗体具有良好的特异性。5.应用Westernblot方法检测鸭FcRy在各组织中的表达利用制备的兔抗鸭FcRy高免血清,用Westernblot方法检测鸭FcRy在各组织中的表达情况。结果显示,在鸭卵巢、输卵管、气管、肺、十二指肠、回肠、肝和肾组织中均有FcRy的表达。在空肠、直肠、心、脾、泄殖腔中未检测到表达。6.应用免疫组织化学方法检测鸭FcRy在体内的表达与分布情况利用纯化的兔抗鸭FcRy多克隆抗体,检测鸭FcRy在体内的表达分布情况。结果显示,在鸭卵巢、输卵管、十二指肠、回肠、肺、气管、肝和肾中均有表达,主要在卵巢被膜(卵巢系膜和表面上皮)、输卵管黏膜上皮、十二指肠黏膜上皮、回肠黏膜上皮中的杯状细胞、肺泡管和细支气管黏膜上皮、气管黏膜上皮、肝中央静脉内皮、肾小管和集合管上皮等部位。
【作者】赵璐;
【导师】李自力;
【作者基本信息】华中农业大学,预防兽医学,2014,硕士
【关键词】鸭;FcRy;原核表达;多克隆抗体;免疫组织化学;

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