棉花果胶甲酯酶基因GhPME6的克隆及初步功能分析

棉花果胶甲酯酶基因GhPME6的克隆及初步功能分析

作者:师大云端图书馆 时间:2016-09-15 分类:硕士论文 喜欢:3039
师大云端图书馆

【摘要】棉花是世界上重要的经济作物,是纺织工业天然纤维的主要来源。棉纤维发育过程可分为纤维细胞起始、伸长、次生壁增厚和脱水成熟四个时期。其中,次生壁加厚与棉纤维比强度形成有着重要关系。然而,当前大部分研究主要集中在棉纤维的起始和伸长阶段,纤维次生壁加厚阶段的研究还很不深入。因此,针对棉纤维次生壁加厚期的遗传机理开展深入研究,克隆控制棉纤维比强度性状形成的关键功能基因,不仅对揭示棉纤维比强度形成的分子机理具有重要意义,而且在纤维比强度遗传改良方面也具有重要的应用价值。果胶甲酯酶(PectinMethylesterase,PME)是植物中普遍存在的一类与细胞壁结构变化相关的酶,可催化细胞壁中的果胶水解产生果胶酸和甲醇,形成了大量的游离羧基端。游离的羧基端与细胞壁中的Ca2+结合形成凝胶,从而提高细胞壁的硬度及坚固性。本研究以陆地棉遗传标准系TM-1为研究材料,利用基因克隆、进化分析、实时荧光定量表达分析、原核蛋白表达和转基因拟南芥功能验证等方法,初步揭示了GhPME6基因在棉纤维发育过程中的作用。本研究结果如下:1、本研究结合棉花基因组数据和本实验室构建的纤维次生壁加厚期cDNA消减文库,获得一条在棉纤维次生壁加厚期优势表达的EST序列。生物信息学分析表明,该EST序列编码部分果胶甲酯酶蛋白序列。2、从陆地棉TM-1中成功克隆到该EST序列的全长基因,命名为GhPME6。3、通过对不同棉属基因组中的PME6基因进行比对分析,发现PME6基因在棉属基因组的进化过程中具有高度保守性。4、qRT-PCR分析显示,GhPME6在纤维发育次生壁加厚期大量表达。5、构建原核表达载体pET30a-GhPME6,在大肠杆菌BL21菌株中完成GhPME6蛋白的原核表达。SDS-PAGE电泳检测表明,原核表达的蛋白分子量约为57KDa,与目的蛋白预期大小相符,并通过Westernblotting进一步验证了原核表达的GhPME6蛋白。6、构建植物表达载体pBI121-GhPME6,成功转化野生型拟南芥(哥伦比亚型)。通过PCR扩增和卡那霉素抗性筛选,获得了T1代转基因拟南芥阳性苗。
【作者】王琳;
【导师】袁有禄;
【作者基本信息】华中农业大学,遗传学,2014,硕士
【关键词】棉纤维;次生壁加厚;果胶甲酯酶;原核表达;转基因拟南芥;

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