核糖体基因区打靶载体介导FVⅢ打靶人胚胎干细胞及其定向分化研究

【摘要】人胚胎干细胞(HumanEmbryonicStemCells,hESCs)因其具有高度的自我更新特性和多向分化潜能,在再生医学、组织工程、基因治疗等领域都有着巨大的研究和应用潜力。近年来,随着基因打靶技术在人胚胎干细胞中的不断尝试,使得经基因组精确修饰后的干细胞有望成为实现遗传病治疗的有效方式。然而要充分实现联合基因打靶和干细胞两种技术在临床应用的可能,我们还需面对一些潜在的困难,例如自发同源重组介导基因打靶的低效性,基因组修饰后的安全性等问题。我们研究小组前期的实验证实,由本室研发的核糖体基因区(rDNA)打靶载体(pHrn)能有效介导外源基因定点整合至多种细胞系的rDNA区并有效表达,且一系列临床细胞遗传学的证据表明该区域可能是外源基因停泊的安全位点。在此基础上,本研究利用pHrn携带人凝血因子Ⅷ(FⅦ)表达框,对hESCs进行基因打靶,以期获得在rDNA区定点整合FⅧ的hESCs细胞克隆,并通过检测打靶后hESCs的干细胞特性是否改变来初步验证rDNA区打靶的安全性。然后将定点整合FⅧ的hESCs分化为适合血友病移植治疗的特定组织细胞,测定分化细胞的特性和生理功能,为联合rDNA区基因打靶及干细胞技术应用于血友病A的基因治疗提供基础。方法：(1)将pHrnFⅦ质粒线性化后,经电转和核转两种方式转染单细胞化的hESCs,梯度加入G418筛选抗性克隆；(2)挑取筛选出的抗性克隆,利用定点整合PCR及SouthenBlot鉴定rDNA区定点整合FⅧ的阳性hESCs克隆；(3)检测定点整合FⅧ克隆的干细胞生物学特性,包括核型鉴定,碱性磷酸酶染色,干细胞表面标志物检测；(4)检测定点整合FⅧ克隆的多潜能性,包括体外定向心肌分化,体外随机向三胚层细胞分化以及体内畸胎瘤形成等实验。(5)由于肝脏是FⅧ的主要合成及分泌器官,因此我们将定点整合FⅧ细胞克隆定向诱导为肝细胞,并通过形态学观测、细胞特异性基因表达、ICG代谢、PAS糖原染色等实验来验证分化后肝细胞的特性及生理功能；(6)我们还将定点整合FⅧ的细胞克隆定向诱导为目前广泛应用于体内移植治疗的间充质干细胞(MSCs),通过形态学观测、流式细胞分析、成骨分化、成脂分化、成软骨分化等验证分化后MSCs细胞的特性及生理功能；(7)RT-PCR及ELISA检测定点整合FⅧ的hESCs以及分化后的肝细胞和MSCs细胞中外源FⅧ的转录及蛋白表达。结果：(1)通过定点整合PCR及SouthernBlot,我们获得了分别经电转和核转后定点整合Ⅷ的hESCs克隆各一个,分别命名为ET5及NT59；(2)两株细胞均保持正常核型且碱性磷酸酶阳性,并表达SSEA-4,TRA-1-60等hESCs特异性标志物,表明仍具备干细胞的特性；(3)体外分化结果显示两株细胞均能分化出Nestin、SMA、AFP标志物阳性的三胚层细胞,同时体内畸胎瘤切片观测到了鳞状上皮、肌肉、消化道等三胚层组织,表明打靶后细胞仍具备多向分化能力；(4)将ET5细胞进行定向肝细胞分化后,可见圆形或多边形等典型肝细胞样细胞；通过RT-PCR、WesternBlot、免疫荧光均检测到了AFP、AlbvAAT、CYP7A1、CYP3A4等肝细胞特异性基因的表达；分化而来的肝细胞能成功摄取及排泌ICG染料且PAS染色阳性,初步证明具备成熟肝细胞的代谢及糖原贮存功能；(5)ET5进行定向MSCs分化后的细胞,在多次传代后具有与BM-MSCs趋于一致的典型成纤维样形态,且增殖能力旺盛；流式分析结果表明分化而来的MSCs细胞表面抗原CD34,CD45阴性,CD44,CD73,CD90阳性,与BM-MSCs一致；经间充质系分化检测,显示分化而来的MSCs同样具备向成骨成脂成软骨的分化能力；(6)RT-PCR检测结果发现,在ET5、ET5分化而来的肝细胞及MSCs细胞中均能检测到外源FⅧ的转录,但是ELISA结果仅检测到了分化后肝细胞中FⅧ蛋白的表达。结论：(1)通过rDNA区打靶载体成功将FⅧ表达框定点整合至hESCs的rDNA区；(2)定点整合FⅧ的hESCs仍然保持多向分化潜能；(3)成功将定点整合FⅧ的hESCs定向诱导为具备特定生理功能的肝细胞；(4)成功将定点整合FⅧ的hESCs定向诱导为MSCs,且与BM-MSCs细胞特性趋于一致,并具备多向分化潜能；(5)定点整合FⅧ的hESCs及其分化而来的肝细胞和MSCs能转录外源FⅦmRNA,但仅在肝细胞中检测到分泌性FⅧ蛋白。
【作者】李卓；
【导师】夏家辉；梁德生；
【作者基本信息】中南大学，遗传学，2013，博士
【关键词】人胚胎干细胞；基因打靶；核糖体基因区；血友病A；定向肝细胞分化；定向MSCs分化；

【参考文献】
[1]汪犇.microRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用及机制研究[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[2]任鹏飞.开孔薄壁钢梁—轻骨料混凝土组合楼板的受力性能研究[D].宁波大学,结构工程,2014,硕士.
[3]万佳宁.词块教学法在高中英语写作教学中的有效性研究[D].渤海大学,学科教学（专业学位）,2014,硕士.
[4]孔倩.需求分析在高职商务英语教学中的应用与探索[D].山东师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[5]陈文勇.高中数学教师专业标准研究[D].华中师范大学,基础数学,2013,硕士.
[6]王荣凯.国有上市公司自愿性信息披露对盈余管理的抑制作用研究[D].华中科技大学,会计,2013,硕士.
[7]蔡金花.丹科集团经营管理信息系统设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[8]熊雨琦.现代纤维艺术综合材料演变研究[D].杭州师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[9]陆巍.从出口贸易看“美国因素”对中国经济增长之影响及对策[D].外交学院,国际关系,2004,硕士.
[10]杜玲.商业展示中的模块化设计[D].清华大学,工业设计,2012,硕士.
[11]圣武松.基于挣值法的项目成本控制研究[D].华南理工大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[12]张澍钰.群体性突发事件政府信息公开的法律研究[D].华东师范大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[13]张倩.《中国日报》和《纽约时报》新闻报道的积极话语对比分析[D].西北师范大学,英语语言文学,2013,硕士.
[14]陈晓曦.我国开放式证券投资基金绩效研究[D].西南财经大学,2005.
[15]张兴.TL-Boost变换器/TL-NPC逆变器级联系统的研究[D].南京航空航天大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[16]姚红良.需求波动、融资约束与研发支出：来自产业和地区面板数据的经验证据[D].复旦大学,西方经济学,2012,硕士.
[17]王素敏.法律视角下我国企业社会责任的实现[D].宁波大学,法律（专业学位）,2014,硕士.
[18]李西娟.重症监护室患者ICU综合征发生的相关因素分析及护理对策[D].吉林大学,护理学,2014,硕士.
[19]李小倩.电梯群控系统调度策略研究与仿真设计[D].南京航空航天大学,系统工程,2013,硕士.
[20]刘芳.表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶抑制剂筛选模型建立[D].重庆医科大学,病理与病理生理学,2004,硕士.
[21]曹晓改.可见/紫外双谱段成像探测主控系统的设计与实现[D].中国科学院研究生院（长春光学精密机械与物理研究所）,电路与系统,2012,硕士.
[22]崔兆宇.超声造影心动图流场信息提取与分析[D].哈尔滨工业大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[23]李亚.暗网数据源分类算法的研究和实现[D].成都理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[24]李惠君.燃料乙醇生产工艺DCS控制系统及其控制策略研究[D].西安建筑科技大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[25]阎登勋.带泊松跳的随机时滞发展方程的适定性、稳定性、整体吸引集和可控性[D].南京师范大学,应用数学,2014,博士.
[26]刘金.马克思精神生产理论研究[D].兰州大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[27]赵航.吉林省和龙市农村社会养老保险问题研究[D].中南林业科技大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[28]沈凤池.P2P网贷平台的现状及监管[J].电子商务,2015,02:10-11.
[29]米雪涛.基于DSP的PWM变频调速系统的设计[D].太原理工大学,电机与电器,2004,硕士.
[30]赵汛.我国住房分配货币化与住房消费研究[D].华中农业大学,土地资源管理,2000,硕士.
[31]刘燕.AlCl_3-Et_3N催化合成三芳基亚胺的研究[D].天津大学,2013.
[32]彭贤锋.汶川地震北川灾区林地土壤种子库研究[D].北京林业大学,工程绿化,2013,硕士.
[33]邱江.直升机主减速器主要性能参数评定方法研究[D].南京航空航天大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[34]王浩业,鲁小华.理工科大学生学习困难分析及干预对策初探——基于北京交通大学的研究[J].思想教育研究,2015,03:85-88.
[35]杜婷茹.无人艇信息网络及控制系统设计[D].大连海事大学,控制工程,2014,硕士.
[36]朱薇.基于语料库的中国英语学习者形名搭配错误分析[D].南京农业大学,英语语言文学,2011,硕士.
[37]胡军.光催化—臭氧联用技术在环境工程中的应用研究[D].大连理工大学,环境工程,2004,硕士.
[38]苏丹丹,刘惠玲,王梦梦.施用粪肥蔬菜基地抗生素残留的研究进展[J].环境保护科学,2015,01:117-120.
[39]汶向前.中低强度自密实混凝土性能及施工技术研究[D].河北工程大学,结构工程,2012,硕士.
[40]王洁.面向地铁突发事件的行车调度系统人误预测研究[D].北京交通大学,2013.
[41]冯健,张化光.基于小波消噪和盲源分离的信号奇异点检测方法[J].控制与决策,2007,09:1035-1038.
[42]张钦,蒋莉萍,裴哲义,王伟胜,迟永宁.2012年UVIG春季会议学术动态报道[J].电力系统自动化,2012,17:1-7.
[43]亓淑杰.范祖禹史鉴思想研究[D].曲阜师范大学,史学理论及史学史,2013,硕士.
[44]高建杰.科普筹资多元化机制研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[45]曹文娟.八十年代小说中的审丑[D].南京师范大学,中国现当代文学,2011,硕士.
[46]罗小平.复合配体对硫酸盐三价铬电沉积的研究[D].重庆大学,化学,2014,硕士.
[47]张贺芳.贵金属及其与聚苯胺复合纳米薄膜的气/液界面制备与电分析应用[D].湖南师范大学,分析化学,2013,硕士.
[48]王建波.当前美国的南海政策与中国的应对策略[D].东北师范大学,国际关系,2012,硕士.
[49]本报记者王静宇.石墨烯“虚火”[N].中国企业报,2011-06-21008.
[50]叶源磊.安庆圣埠战国墓群的发掘整理及其相关问题[D].安徽大学,考古及博物馆学,2013,硕士.