靶向抑制HCCR-1的表达增加吉非替尼对食管鳞癌的敏感性研究

【摘要】食管癌是一种最为常见的消化道恶性肿瘤，是全球第六位致死性的肿瘤。根据组织学类型，食管癌主要分为两种类型：腺癌和鳞癌，两种类型均具有不良预后。尽管在过去的三十年里，食管腺癌的发生率在美国和欧洲显著增加，但食管鳞癌仍然是主要的组织学类型。食管癌的发生率具有明显的地域差异，其高发生率主要在中国、亚洲中南部、东非和南非，尤其在中国的河南省林州和安阳市。目前，食管鳞癌的5年生存率很低，大约为5%－10%，多于50%的病人在诊断时发现有远端转移。因此，寻找新的分子靶点诊断和改善食管鳞癌病人的预后具有十分重要的意义。人宫颈癌基因-1（HumanCervicalCancerOncogene，HCCR-1）是由Ko等发现的与人类多种肿瘤相关的基因，是采用差异显示反转录PCR技术从原发性肿瘤组织、转移灶和肿瘤细胞系中筛选出候选的差异表达基因之一，并鉴定了几个新的癌基因，其中包括HCCR基因，该基因被证实在原发性宫颈癌和宫颈癌细胞系中过表达。HCCR根据其分子特征，主要分为两种类型：HCCR-1和HCCR-2两种蛋白剪接变异体。HCCR-1编码360个氨基酸，分子量大约为42kDa，HCCR-2编码304个氨基酸，分子量大约为36kDa。它们的结构中具有2个潜在的N-十四烷基化位点，2个潜在的蛋白激酶C的磷酸化位点，N-糖基化位点以及包含20个氨基酸的疏水跨膜结构域，这些复杂的结构暗示其功能的多样性。目前，越来越多的研究显示，HCCR-1作为癌基因在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，并且在多种不同的肿瘤中过表达，包括乳腺癌、胰腺癌、结肠癌和肝癌等，提示HCCR-1可能成为这些肿瘤诊断和治疗的分子靶点。最为重要的是，HCCR-1能通过多种不同的分子机制影响肿瘤的发生发展，研究显示，TCF/beta-catenin在HCCR-1原癌基因的表达中发挥重要作用，在PANC-1胰腺癌细胞中表皮生长因子（EGF）能够通过PI3K/Akt/mTOR信号途径诱导HCCR的表达。这些研究表明HCCR-1在肿瘤发生发展过程中牵涉的分子机制是多方面的，从而揭示其在肿瘤发生发展中的重要地位。吉非替尼是一种口服的活化的表皮生长因子受体酪氨酸激酶的抑制剂，已经被证实对多种不同肿瘤具有抗肿瘤活性，包括头颈部肿瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、恶性间皮瘤和结肠癌等。最近，食品和药物管理局批准吉非替尼作为治疗晚期非小细胞肺癌的靶向药物，在其它肿瘤中的临床试验尚在研究。I期和II期临床的研究表明，吉非替尼不仅有较强的抗肿瘤活性而且具有很好的耐受性。此外，吉非替尼作为EGFR的选择性抑制剂能够以浓度依赖的方式阻断头颈部肿瘤中外源性EGF诱导的VEGF-C和VEGF-A的表达。上述这些研究提示HCCR-1、吉非替尼和EGF之间在肿瘤细胞中存在某种内在联系，因此在本研究中我们通过三部分内容阐明HCCR-1和吉非替尼在食管鳞癌发生发展中的可能作用及其分子调控机制，该研究旨在为食管鳞癌的分子靶向治疗提供理论依据。第一部分HCCR-1在食管鳞癌组织中的表达及其与食管鳞癌病人预后的关系方法（1）采用原位杂交技术检测158例食管鳞癌组织、105例不典型增生组织和158例正常食管黏膜组织中HCCR-1mRNA的表达。（2）采用免疫组织化学方法检测158例食管鳞癌组织、105例不典型增生组织和158例正常食管黏膜组织中HCCR-1蛋白的表达。（3）采用实时荧光定量PCR分析随机选择的6例食管鳞癌组织和相应的6例正常食管黏膜组织中HCCR-1mRNA的表达水平。（4）采用Westernblotting检测随机选择的6例食管鳞癌组织和相应的6例正常食管黏膜组织中HCCR-1蛋白的表达水平。（5）采用Kaplan-Meier生存曲线分析HCCR-1mRNA和蛋白表达与食管鳞癌病人存活时间之间的关系。（6）统计学处理：应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用xs表示。原位杂交和免疫组织化学结果采用X2进行评估，实时荧光定量PCR和Westernblotting结果采用单因素方差分析（One-wayANOVA），HCCR-1mRNA和蛋白表达和食管鳞癌病人预后之间的关系采用Kaplan–Meier存活曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。结果（1）HCCR-1mRNA主要定位于食管鳞癌细胞质中，食管鳞癌组织中HCCR-1mRNA表达的阳性率（77.22%）显著高于不典型增生组织（36.19%）和正常食管黏膜组织（3.16%），且差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）HCCR-1蛋白主要定位于食管鳞癌细胞质中，食管鳞癌组织中HCCR-1蛋白表达的阳性率（79.75%）显著高于不典型增生组织（40.95%）和正常食管黏膜组织（3.80%），且差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）HCCR-1mRNA和蛋白的表达均与食管鳞癌病人的性别和年龄无关（P>0.05），但与病人的组织学分级、TNM分期和淋巴结转移均密切相关（P<0.05）。最为显著的是，在80例转移的食管鳞癌病人中HCCR-1mRNA和蛋白表达的阳性率为100%。（4）相关性分析结果表明，在122例HCCR-1mRNA表达阳性的组织中发现110例HCCR-1蛋白的阳性表达，而36例HCCR-1mRNA表达阴性的组织中发现20例HCCR-1蛋白的阴性表达，HCCR-1mRNA和蛋白的表达具有显著的相关性（γ=0.447，P<0.001）。（5）实时荧光定量PCR和Westernblotting结果表明，在随机选择的6例食管鳞癌组织中HCCR-1mRNA和蛋白表达均显著高于正常食管黏膜组织，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）在随访期间，104例HCCR-1mRNA阳性的食管鳞癌病人中有72例已经死亡，其死亡率为69.23%，而54例HCCR-1mRNA阴性或弱阳性的食管鳞癌病人有17例已经死亡，死亡率为31.48%，通过log-rank检验（Mantel-Cox）发现HCCR-1mRNA低表达的食管鳞癌病人的存活时间显著长于HCCR-1mRNA高表达的食管鳞癌病人，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）在随访期间，113例HCCR-1蛋白阳性的食管鳞癌病人中有77例已经死亡，其死亡率为68.14%，而45例HCCR-1蛋白阴性或弱阳性的食管鳞癌病人有15例已经死亡，死亡率为33.33%，通过log-rank检验（Mantel-Cox）发现HCCR-1蛋白低表达的食管鳞癌病人的存活时间显著长于HCCR-1蛋白高表达的食管鳞癌病人，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（8）Cox比例风险模型结果表明，临床阶段和淋巴结转移是食管鳞癌独立的预后因子。第二部分靶向抑制HCCR-1表达增加吉非替尼对食管鳞癌细胞的敏感性方法（1）采用实时荧光定量PCR和Westernblotting技术检测3株食管鳞癌细胞（Eca109、EC1和EC9706）和非癌食管上皮细胞Het-1A中HCCR-1mRNA和蛋白的表达。（2）利用HCCR-1siRNA转染食管鳞癌EC1细胞，采用实时荧光定量PCR和Westernblotting技术检测转染前后HCCR-1mRNA和蛋白的表达。（3）将HCCR-1siRNA转染食管鳞癌EC1细胞后的24h、48h、72h和96h，采用CCK-8试剂检测EC1细胞的增殖能力，同时采用不同浓度的吉非替尼（0.1M、1M、10M、20M和40M）处理食管鳞癌EC1细胞，采用CCK-8试剂检测处理后48h后细胞的增殖能力。（4）采用流式细胞术检测不同处理组（未处理组、对照siRNA组、HCCR-1siRNA组、吉非替尼组和HCCR-1siRNA和吉非替尼联合组）的细胞周期和细胞凋亡的变化。（5）采用Transwell小室检测不同处理组的细胞侵袭能力的变化。（6）采用Westernblotting技术检测不同处理组中细胞周期相关蛋白（cyclinD1、cdk2和p21）、细胞凋亡相关蛋白（bcl-2和bax）、细胞侵袭相关蛋白（MMP-2和MMP-9）和Akt信号途径中的关键蛋白（p-Akt和总Akt）的表达水平。（7）统计学处理：采用SPSS17.0软件进行统计学处理，数据以xs表示，两组数据间比较用独立样本t检验，三组数据及以上行单因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05表示具有显著性差异。结果（1）3株食管鳞癌细胞（Eca109、EC1和EC9706）中HCCR-1mRNA和蛋白的相对表达水平均显著高于非癌的食管上皮细胞Het-1A，而食管鳞癌EC1细胞中HCCR-1mRNA和蛋白的相对表达水平又显著高于Eca109和EC9706细胞，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（2）与未处理组和对照siRNA组相比，转染HCCR-1siRNA后24h、48h和72h的EC1细胞中HCCR-1mRNA和蛋白的表达显著下调，且差异具有统计学意义（P<0.05），其中转染HCCR-1siRNA后的48h，HCCR-1mRNA和蛋白的表达水平最低。（3）CCK-8细胞增殖实验结果显示，与未处理组和对照siRNA相比，HCCR-1siRNA处理的不同时间点食管鳞癌EC1细胞的增殖显著受到抑制，且显差异具有统计学意义（P<0.05），然而未处理组和对照siRNA组之间食管鳞癌EC1细胞的增殖无差异（P>0.05）。（4）吉非替尼以浓度依赖的方式抑制食管鳞癌EC1细胞的增殖，在剂量40M的吉非替尼对食管鳞癌EC1细胞的抑制效果较佳，抑制率为92.14%，显著高于其它各组，差异具有统计学意义（P<0.05）。而1M和10M的吉非替尼对食管鳞癌EC1细胞的抑制率分别为42.5%和56.5%，与其它各组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）未处理组和对照siRNA中EC1细胞在G0/G1期的比率分别为45.390.64%和46.370.63%，二者之间无统计学差异（P>0.05）。与未处理组和对照siRNA组相比，HCCR-1siRNA组（58.330.83%）、吉非替尼组（57.630.76%）和联合组（71.580.87%）在G0/G1期的细胞数比率显著升高，且差异具有统计学意义（F=600.333，P=0.000）。最为显著的是，HCCR-1siRNA和吉非替尼联合处理组中G0/G1期细胞数的比率最高。此外，未处理组和对照siRNA中EC1细胞在S期的比率分别为24.150.89%和22.021.45%，二者之间无统计学差异（P>0.05）。HCCR-1siRNA组和吉非替尼组在S期的比率分别为29.301.99%和29.430.79%，二者之间无统计学差异（P>0.05），但显著高于未处理组和对照siRNA组，组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。联合处理组中在S期的比率为13.050.80%，显著低于以上各组（P<0.05）。（6）HCCR-1siRNA组、吉非替尼组和联合组中食管鳞癌EC1的早期凋亡率分别为26.731.73%、23.632.48%和31.792.04%，显著高于未处理组（11.391.62%）和对照siRNA组（11.691.30%），差异具有统计学意义（F=71.196，P=0.000），而未处理组和对照siRNA组中食管鳞癌EC1的早期凋亡率无差异（P>0.05），此外，联合处理组中食管鳞癌EC1细胞的早期凋亡率与其它各组相比，均显著上升，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HCCR-1siRNA组、吉非替尼组和联合组中食管鳞癌EC1的穿膜的细胞数分别为139.227.37、160.626.75和48.822.77，显著低于未处理组（269.426.70）和对照siRNA组（252.827.90），差异具有统计学意义（F=58.244，P=0.000），而未处理组和对照siRNA组中食管鳞癌EC1的穿膜的细胞数无差异（P>0.05），此外，联合处理组中食管鳞癌EC1细胞的穿膜细胞数与其它各组相比，均显著降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（8）未处理组和对照siRNA组中食管鳞癌EC1细胞的细胞周期相关蛋白（cyclinD1、cdk2和p21）、细胞凋亡相关蛋白（bcl-2和bax）、细胞侵袭相关蛋白（MMP-2和MMP-9）和Akt信号途径中的关键蛋白（p-Akt和总Akt）的表达水平在统计学上无差异（P>0.05）；然而，与未处理组和对照siRNA组相比，HCCR-1siRNA组和吉非替尼组中cyclinD1、cdk2、bcl-2、MMP-2、MMP-9和p-Akt蛋白的表达显著下调，而p21和bax蛋白表达显著上调，且差异具有统计学意义（P<0.05）。最为显著的是，当HCCR-1siRNA和吉非替尼联合作用于食管鳞癌EC1细胞后，上述蛋白的表达水平改变最为显著，与其它各组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。第三部分HCCR-1siRNA联合吉非替尼在食管鳞癌裸鼠移植瘤中的作用方法（1）实验分组：未处理组：不采用任何方式进行治疗；对照siRNA组：在瘤体内注射对照siRNA，每3天一次；HCCR-1siRNA组：在瘤体后注射HCCR-1siRNA，每3天一次；吉非替尼组：口腔灌注吉非替尼（150mg/kg）；HCCR-1siRNA和吉非替尼联合组：在瘤体后注射HCCR-1siRNA，每3天一次，并口腔灌注吉非替尼（150mg/kg）。（2）收集食管鳞癌EC1细胞，将5×106细胞接种于裸鼠右侧背部皮下。当肿瘤体积达到100mm3左右时，开始治疗，每3天采用游标卡尺精确测量肿瘤的长径a（mm）和短径b（mm），利用公式V=1/2ab2（mm3）计算每个裸鼠的肿瘤体积，并绘制各组肿瘤的生长曲线。治疗3w后处死小鼠，剥离肿瘤，并称量肿瘤的重量，计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=[(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重]×100%。（3）采用免疫组织化学检测不同组别的食管鳞癌裸鼠移植瘤中Ki-67蛋白的表达。（4）采用实时荧光定量PCR检测不同组别的食管鳞癌裸鼠移植瘤中HCCR-1mRNA的表达。（5）采用Westernblotting技术检测不同组别的食管鳞癌裸鼠移植瘤中HCCR-1、p-Akt和总Akt蛋白的表达。（6）统计学处理：所有的实验数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用x±s表示，两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较应用单因素方差分析。以P<0.05表示具有统计学差异。结果（1）未处理组和对照siRNA组之间食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤的肿瘤的体积大小无差异（P>0.05），而与未处理组和对照siRNA组相比，HCCR-1siRNA组和吉非替尼组中食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤的体积显著变小，且差异具有统计学意义（P<0.05）。最为显著的是，当HCCR-1siRNA与吉非替尼联合治疗时，食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤的体积显著低于其它各组，且在统计学上具有显著性差异（P<0.05）。（2）未处理组和对照siRNA组中食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤的重量在统计学上无差异（P>0.05），而与未处理组和对照siRNA组相比，HCCR-1siRNA组和吉非替尼组中食管鳞癌裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为38.83%和43.92%，其移植瘤的重量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。此外，HCCR-1siRNA联合吉非替尼组中的抑瘤率为77.25%，且差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）未处理组和对照siRNA组的食管鳞癌裸鼠移植瘤中HCCR-1mRNA和蛋白的表达无差异（P>0.05），而与未处理组和对照siRNA组相比，HCCR-1siRNA组、吉非替尼组以及联合处理组的食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤中HCCR-1mRNA和蛋白的表达显著下调，其中联合组中HCCR-1mRNA和蛋白的表达水平最低。（4）未处理组和对照siRNA组的肿瘤细胞Ki-67的增殖指数分别为85.77±2.40%和84.87±2.42%，二者在统计学上无差异（P>0.05），此外，HCCR-1siRNA组、吉非替尼组和联合处理组中Ki-67的增殖指数分别为：47.85±3.23%、56.52±3.73%和31.26±2.69%，三者之间相比差异具有统计学意义（P<0.05），其中联合处理组中肿瘤细胞的Ki-67的增殖指数最低。（5）未处理组和对照siRNA组的食管鳞癌裸鼠移植瘤中p-Akt和总Akt蛋白的表达无差异（P>0.05），而与未处理组和对照siRNA组相比，HCCR-1siRNA组、吉非替尼组以及联合处理组的食管鳞癌EC1裸鼠移植瘤中p-Akt蛋白的表达显著下调，其中联合处理组中p-Akt蛋白的表达水平最低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。结论（1）HCCR-1mRNA和蛋白的高表达可能与食管鳞癌的发生发展密切相关。（2）HCCR-1mRNA和蛋白水平可能成为食管鳞癌转移和预后的分子标记。（3）HCCR-1siRNA和吉非替尼联合显著抑制食管鳞癌细胞的增殖，积累G0/G1期的细胞数、诱导细胞凋亡和降低细胞的侵袭能力，这可能与细胞周期相关蛋白（cyclinD1、cdk2和p21）、细胞凋亡相关蛋白（bcl-2和bax）、细胞侵袭相关蛋白（MMP-2和MMP-9）的表达变化以及Akt信号途径的活化状态密切相关。（4）HCCR-1siRNA和吉非替尼联合显著抑制食管鳞癌裸鼠移植瘤的生长，这可能与Ki-67的增殖指数的降低和Akt信号途径的失活密切相关。（5）HCCR-1siRNA和吉非替尼在体内外抗食管鳞癌的增殖中具有协同效应。
【作者】刘莺；
【导师】樊青霞；
【作者基本信息】郑州大学，肿瘤学，2014，博士
【关键词】人宫颈癌癌基因-1；食管鳞癌；预后；增殖；细胞周期；凋亡；侵袭；裸鼠移植瘤；

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