中国番茄黄化曲叶病毒卫星DNA抑制转录后基因沉默的机理研究

【摘要】中国番茄黄化曲叶病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus,TYLCCNV)伴随的卫星DNAβ(TomatoyellowleafcurlChinabetasatellite,TYLCCNB)对于诱导症状、增强病毒的致病性及抑制RNA沉默是必需的,而TYLCCNB编码唯一的βCl蛋白不仅是致病因子,也是RNA沉默抑制子。但到目前为止,βC1抑制RNA沉默的机理尚不清楚。为了解析βCl蛋白抑制RNA沉默的机制、明确RNA沉默途径中抵抗双生病毒侵染的关键基因的作用,本文开展了以下研究：1βC1蛋白抑制RNA沉默的机制：我们利用芯片技术比较了TYLCCNV/TYLCCNB和TYLCCNV侵染本氏烟后差异性表达的基因,以及βC1转基因本氏烟植株相对于野生型植株的差异性表达的基因。我们发现TYLCCNB或βC1显著上调本氏烟一个钙调素类似蛋白基因Nbrgs-CaM的表达,而且TYLCCNB的侵染还能够上调普通烟和番茄中Nbrgs-CaM同源物的表达。我们利用经典的农杆菌浸润RNA沉默抑制试验,发现本氏烟、普通烟和番茄rgs-CaMs都能够抑制转录后基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS),而且Nbrgs-CaM还能抑制TYLCCNV诱导的基因沉默,因此证明了这些rgs-CaMs是植物内源的RNA沉默抑制子。我们利用35S启动子转基因过量表达Nbrgs-CaM,发现转基因植株表现出与βC1转基因植株类似的发育缺陷表型。通过构建Nbrgs-CaM双链发夹RNA沉默载体获得了Nbrgs-CaM基因表达下调的转基因植株,我们发现在该转基因植株上βC1失去了诱导典型症状及抑制PTGS的能力,表明Nbrgs-CaM介导了βCl诱导症状及抑制PTGS的功能。此外,我们还发现Nbrgs-CaM及其在普通烟与番茄中的同源物对TYLCCNV在茄科寄主中的致病力起了重要作用。2RDR6介导的RNA沉默在抵御双生病毒侵染中的作用：通过分析pC1与Nbrgs-CaM对正链RNA及双链RNA介导RNA沉默的抑制,我们发现两者只能抑制正链RNA诱导的PTGS,而不能抑制双链RNA诱导的PTGS,同时发现它们也只能抑制次级小干扰RNA(smallinterferingRNAs,siRNAs)的产生而不能抑制初级siRNAs的产生。进一步分析发现βC1通过上调Nbrgs-CaM的表达抑制NbRDR6介导的RNA沉默,而NbRDR6沉默的转基因植株不仅阻断了TYLCCNV诱导的基因沉默,还表现出对双生病毒侵染的超敏感性。另外,我们发现RDR6在决定双生病毒的寄主范围中起重要的作用,TYLCCNV能够突破寄主限制侵染拟南芥rdr6突变体。3SGS3介导的RNA沉默在抵御双生病毒侵染中的作用：在拟南芥中,RDR6可与双链RNA结合蛋白SGS3互作并形成复合体,在次级siRNAs合成中起重要作用。为了研究Nbrgs-CaM是否会影响NbSGS3的功能,我们克隆了NbSGS3基因并对其功能进行分析。我们发现NbSGS3在正链RNA诱导的基因沉默、GFP系统沉默的建立及维持、双生病毒诱导的基因沉默及双生病毒的抗性方面起了重要作用,而且NbSGS3能够协同NbRDR6参与对双生病毒的抗性。此外通过酵母双杂交与双分子荧光互补实验,我们还发现Nbrgs-CaM与NbSGS3能够互作,并且Nbrgs-CaM的过表达不仅能够影响NbSGS3的亚细胞定位,使其不能定位于’siRNA-bodies’上,也会降低NbSGS3蛋白在植物中的表达水平。4DNAβ上调Nbrgs-CaM表达的机理分析：利用甲基化抑制剂和Chop-PCR方法对Nbrgs-CaM启动子进行甲基化分析,我们发现其启动子处于甲基化状态,而且表达βC1能够降低Nbrgs-CaM启动子的甲基化水平；对pC1的核定位突变体进行分析,我们发现该突变体不仅不能抑制Nbrgs-CaM启动子的甲基化,也不能上调Nbrgs-CaM的表达及抑制PTGS.对Nbrgs-CaM启动子的序列进行克隆,我们获得了该启动子驱动报告基因GUS和GFP表达的转基因本氏烟植株,并且发现TYLCCNV伴随的TYLCCNB的侵染能够特异地上调Nbrgs-CaM启动子驱动的报告基因的表达。我们的这些发现阐述了一个全新的机制：病毒编码的RNA沉默抑制子能够利用植物内源RNA沉默抑制子Nbrgs-CaM抑制RNA沉默及诱导症状,并强调了RDR6与SGS3在抵抗双生病毒侵染的RNA防卫反应中的重要地位；同时我们也发现了βC1抑制TGS产生的效应能够作用于PTGS,从而明确了βC1在抑制TGS与PTGS这两个途径之间的关系。
【作者】李方方；
【导师】周雪平；李正和；
【作者基本信息】浙江大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】中国番茄黄化曲叶病毒；βC1蛋白；钙调素类似蛋白；转录后基因沉默；RNA依赖的RNA聚合酶6；基因沉默抑制子3；甲基化；

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