~(131)I标记抗NRP-1单克隆抗体在荷胶质瘤裸鼠体内分布和SPECT/CT显像研究

【摘要】背景介绍放射免疫显像(radioimmunoimagine,RII)在肿瘤早期诊断中占据重要地位,FDA已经批准了五种基于RII抗体药物用于临床肿瘤显像。但目前,现有靶点的RⅡ分子探针面临肿瘤显像探测效能不足,并存在假阴性等诸多难题。开发针对新靶点的分子探针,是RⅡ不断发展成熟的关键所在。神经鞭毛素受体-1(neuropilin-1,NRP-1),是Semaphorin3A和血管内皮生长因子(VEGF)的共受体,参与肿瘤血管新生,肿瘤生长和转移。它在多种肿瘤组织中高表达,并与肿瘤的恶性程度密切相关,被认为是一个很有前景的肿瘤显像与治疗靶点。但目前针对NRP-1靶点分子显像,尚缺乏有效的特异性探针,为了发展靶向NRP-1的靶向显像药物,我们实验室前期通过杂交瘤技术制备了一株靶向NRP-1的功能性单克隆抗体–A6,本课题拟采用碘131标记的抗神经鞭毛素抗体(131I-A6-MAb)做为分子探针,探讨131I-A6-MAb体外特性、在荷瘤裸鼠中的生物学分布特征及其靶向显像特性。实验方法(1)我们通过用rProteinA亲和柱纯化将抗NRP-1抗体从小鼠腹水中纯化,并且通过SDS-PAGE鉴定抗体的纯度,ELISA方法鉴定抗体的亲和力。(2)采用Iodogen法标记碘131和抗神经鞭毛素(Neuropilin-1NRP-1)单克隆抗体,制备131I-A6-MAb探针,凝胶柱分离法纯化131I-A6-MAb探针,放射性纸层析法(TLC)鉴定131I-A6-MAb放化纯度,Elisa法鉴定131I-A6-MAb免疫活性,体外观测法鉴定131I-A6-MAb稳定性。(3)选用U87胶质瘤细胞株,采用细胞摄取实验测定探针结合特异性,饱和结合实验测定探针结合力,细胞内吞实验测定探针内吞速率。(4)建立人胶质瘤U87细胞裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为4组,每组4只,通过尾静脉注射131I-A6-MAb7.4MBp与未标记抗体(0、2.5mg/kg,5mg/kg、10mg/kg),并于注射后24、48、72、96和120h处死小鼠。取血、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、骨骼、肌肉、甲状腺及肿瘤组织,测质量及放射性计数,经时间衰减校正后计算每克组织的放射性摄取率(%ID/g)。(5)将荷U87MG胶质瘤模型裸鼠随机分2组,一组为未阻断组,另一组为阻断组,每组4只,经尾静脉注射7.4MBq131I-A6MAb(即未阻断组)或与700μg未标记抗体同时注射(即阻断组),于注射后不同时间点(12、24、48、72、96、120h)行SPECT/CT显像。实验结果(1)SDS-PAGE检测显示经纯化的抗NRP-1抗体A6的纯度为95%,浓度为4mg/mL;ELISA检测抗体的亲和力为原腹水结合力的76%。(2)纸层析法结果计算表明,131I-A-6-MAb标记率为98%,放化纯为98%；96h稳定性测试表明,131I-A6-MAb在室温下存放以及在PBS溶液中,其标记率仍然都维持在85%以上,说明其具有良好的体外稳定性。(3)细胞实验显示,131I-A6-MAb可特异性结合U87MG细胞表面NRP-1抗原,并在1h时达到高峰为15.80±1.30%；其与细胞表面抗原亲和力%)为1.67±0.14nM,与抗原结合后的细胞内吞速率为25.±3.0%(8h),表明了131I-A6-MAb能特异性、高亲力地结合于U87MG细胞表面NRP-1受体。(4)生物学分布实验显示,131I-A6-MAb可特异性靶向肿瘤组织,未阻断组与阻断组(2.5.5.10mg/kg),裸鼠肿瘤组织摄取在24h摄取值分别为6.0±1.2、8.8±1.7、11.4±2.0、8.2±1.4ID%/g,阻断后可提高肿瘤摄取131I-A6-MAb(P<0.05),其中用5mg/kg时肿瘤摄取131I-A6-MAb最高,而用10mg/kg时肿瘤摄取131I-A6-MAb就受至抑制；肝脏摄取在24h分别为7.6±1.5、6.4±0.9、5.8±0.7、6.0±0.8ID%/g,阻断组与为阻断组肝脏摄131I-A6-MAb取虽然被抑制,但差别无统计学意义(P>0.05)；131I-A6-MAb体内放射性剂量随时间延长逐渐下降,其中在血液中清除最快,120h时各组血浆中放射性浓度分别为0.8±0.1、1.2±0.3、2.0±0.3、6.0±1.3ID%/g；肿瘤/血浆比值(T/B)在120h达到最高,为1.8±0.50、2.3±0.7、2.4±0.6、0.9±0.2,表明肿瘤组织特异性结合131I-A6-MAb,正常组织不结合或很少特异性摄取131I-A6-MAb.(5)SPECT/CT显像结果显示,尾静脉注射131I-A6-MAb后12h肿瘤显影,随时间的延长,肿瘤影像越清楚,至48h时最清晰,而在700μg未标记抗体阻断后,肿瘤影像明显受抑制。提示131I-A6-MAb能特异性结合于肿瘤组织。结论(1)我们建立抗NRP-1抗体亲和层析纯化方法,获得一批高亲和力的抗NRP-1抗体A6。(2)我们成功制备131I-NRP-1A6b分子探针,31I-A6-MAb的标记方法简单,易行,标记率高,稳定性好,具有良好的NRP-1的靶向性和特异性,有望成为一种新型肿瘤诊断和治疗的药物。(3)阻断正常组织摄取可提高肿瘤组织摄取,而5mg/kg可能为最佳阻断剂量。
【作者】豆晓锋；
【导师】苏新辉；
【作者基本信息】厦门大学，影像医学与核医学，2014，硕士
【关键词】脑胶质瘤；神经鞭毛素受体-1；单克隆抗体；放射性核素显像；裸鼠；

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