组蛋白单泛素化E3连接酶、mediator complex亚基和维生素B6合成途径在番茄对灰霉病抗性反应中的功能研究

【摘要】灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)是一种广主寄生的死体营养型病原真菌,在多达上百种植物上引起灰霉病。大多数植物缺乏对灰霉病的有效抗性资源,但是植物自身形成了多种防御机制来抵御B.cinerea的侵染。为了研究番茄对灰霉病的抗性机制,我们利用病毒诱导基因沉默(virus-inducedgenesilencing,VIGS)技术研究了组蛋白H2B单泛素化E3连接酶SlHUB1和SlHUB2、mediatorcomplex中的部分亚基以及维生素B6从头合成途径基因在番茄对灰霉病抗性反应中的功能及其可能机制。组蛋白单泛素化形成的ub-H2B主要与转录激活染色质结合,激活转录延伸。在拟南芥中,组蛋白H2B单泛素化途径不仅参与植物生长发育过程,还具有调节植物对死体营养型真菌抗性的作用。但是在番茄中组蛋白单泛素化途径在生长发育及抗病性中的作用还不是很清楚。在本研究中,我们克隆鉴定了2个拟南芥HUB1和HUB2在番茄中的同源蛋白S1HUB1和S1HUB2,并通过体外酶活性测定实验证明S1HUB1和S1HUB2具有体外单泛素化H2B的E3连接酶活性。同时,VIGS技术分别沉默SlHUB1和SlHUB2后,发现沉默植株相比对照植株对B.cinerea抗性明显减弱。在拟南芥中曾有报道指出HUB1与MED21互作,而且MED21参与了植株对B.cinerea的抗性。但是在番茄植株中,虽然S1HUB1能够与SlMED21在酵母中互作,但是沉默SlMED21后番茄植株并不表现出对B.cinerea抗性的改变。由此推测番茄中S1HUB1可能并不通过S1MED21来调控对B.cinereα的抗性。基因表达分析后发现,SlHUBl和SlHUB2能够被B.cinerea诱导表达,同时在SA或者ACC处理后其表达量显著上升。进一步研究表明,SlHUB1或者SlHUB2沉默植株的细胞壁厚度相比对照植株显著减小,其叶片的失水率也有增加。在B.cinerea侵染后,SlHUB1或SlHUB2沉默植株中活性氧和胼胝体大量积累,参与木质素合成的相关基因表达量下降,SA途径基因表达明显上调,而JA和ET途径基因表达显著下降。上述结果表明,S1HUB1和S1HUB2在番茄抗灰霉病过程中起着重要作用,其功能的缺失可能影响了细胞壁的合成及强化从而减弱了番茄对B.cinerea的基础抗性,同时SlHUB1和S1HUB2可能作用于SA途径,其功能的缺失可能增强了B.cinerea诱导的SA途径的响应,从而抑制了JA和ET途径,同时导致了活性氧的大量产生积累及坏死区域的扩大,从而有利于B.cinerea的侵染。Mediatorcomplex是真核生物中多蛋白组成的功能保守的复合体,作为RNA聚合酶Ⅱ的辅助因子,在转录机制中起关键作用。本研究中,我们通过同源比对搜索到了番茄基因组中可能的25个Mediatorcomplex亚基基因(SlMED)信息。通过qRT-PCR方法分析了这些基因的表达模式,包括B.cinerea以及激素SA/JA/ACC处理后基因的表达情况,结果显示：B.cinerea处理后,SlMED6、SlMED12、SlMED13、SlMED14、SlMED15、SlMED19a、SlMED23、SIMED25、SlMED31、SjMED36和SlMED37a表达量相比对照上调3倍以上；SA处理后,相比对照处理,SlMED7α、SjMED13、SlMED28、SlMED31、SlMED34上调表达3倍多;ACC处理后,SlMED5α、SlMED12、SlMED13、SlMED14、SlMED16和SlMED25表达量是对照的3倍多。利用VIGS技术分别沉默这些基因后观察番茄植株生长发育情况,发现SlMED8、SlMED10b、SlMED12、SlMED14、SlMED15、SlMED16、SlMED17或SlMED25基因沉默后植株表现出生长缺陷,如生长缓慢或者叶片畸形等。同时,我们利用VIGS技术研究这些亚基在番茄抗灰霉病过程中的作用。对沉默植株接种B.cinerea进行表型分析后,我们发现SlMED5b、SlMED8、SlMED15、SlMED16、SlMED17、SlMED18、SlMED20b、SlMED25或SlMED28基因沉默后改变了番茄对B.cinerea的抗性,可能这些基因在番茄抗灰霉病过程中起作用,其中SlMED8、SlMED15、SlMED16、SlMED18和SlMED25基因沉默后植株对B.cinerea的抗性下降,其功能与拟南芥中其同源基因在抗病性中的作用类似,而SlMED5b、SlMED17、SlMED20b和SlMED28在拟南芥中还没有抗病相关性的报道。我们的研究结果表明,SlMED17和SlMED20b可能正向调控番茄对灰霉病的抗性,而SlMED5b和SlMED28可能负调控番茄对灰霉病的抗性。维生素B6是动植物的基本代谢产物,作为多种代谢酶的重要辅助因子,参与动植物的基本代谢活动,如氨基酸的合成代谢；糖类、脂类的代谢；植物中叶绿素、乙烯等物质的合成。同时,它还具有抗氧化活性,在细胞内抗氧化防御体系中具有重要的调节作用。许多研究结果表明,维生素B6作为有效的抗氧化剂,在植物的生长发育及其响应环境胁迫的过程中发挥了重要作用。但是有关维生素B6在植物抗病性中的功能还不是很清楚。在本次实验中,我们克隆鉴定了4个番茄维生素B6合成途径的相关基因,其中SlPDX1.2、SlPDX1.3和SlPDX2参与维生素B6的从头合成途径,SlSOS4参与维生素B6的补救途径。接下来,我们通过VIGS的方法来研究维生素B6在番茄抗灰霉病中的作用,结果表明,SlPDXl.2或者SlPDXl.3基因沉默植株对B.cinerea抗性减弱。进一步研究表明,B.cinerea侵染后,SlPDXl.2或SlPDX1.3沉默植株中B.cinerea诱导的维生素B6含量下降,活性氧增加,超氧阴离子的清除能力下降,超氧化物歧化酶的活性增强。而SlPDX2和SlSOS4基因沉默植株在B.cinerea侵染后病害表型与对照植株无明显区别。以上结果表明,维生素B6可能通过调整细胞内的抗氧化能力来调控番茄植株对灰霉病的抗性,其中从头合成途径起着更为重要的作用。
【作者】张雅芬；
【导师】宋凤鸣；
【作者基本信息】浙江大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】病毒诱导基因沉默技术；SlHUB1；SlHUB2；mediatorcomplex；维生素B6；.SlPDX1.2；.SlPDX1.3；灰霉病菌(Botryiscinerea)；番茄；

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