EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的制备与评价

【摘要】目的：旨在构建EGFR靶向负载Survivin-siRNA的Staramine修饰的阳离子脂质体(EGFR-PEG-SCLs-siRNA)，对其进行制剂学评价，考察其细胞毒性、靶向性、体外摄取、摄取机制以及体外药效学评价，并筛选出沉默效率最高的siRNA链等前期工作，为后续制成干粉吸入剂用于肺部给药、发挥药效提供实验依据。方法：本文通过油酰氯成酯后，发生酰胺反应得到类脂质载体Staramine。另外，在纳米载体外，进行PEG修饰，最后通过TLC、1H-NMR、FT-IR等手段对各产物进行结构表征。Westernblot法筛选出最高沉默效率的Survivin-siRNA链。采用乙醇注入法制备脂质体，静电吸附负载siRNA。通过对其粒径、Zeta电位、包封率、抗RNase酶稳定性的评价对脂质体进行表征和评价。体外评价以高表达Survivin的人源性肺腺癌耐顺铂株A549/DDP细胞为模型，以MTT法评价载体安全性，原子力显微镜观察细胞对脂质体的摄取作用。以市售制剂Lipofectamine-2000作为阳性对照，采用流式细胞仪考察脂质体的摄取，摄取机制，以及细胞凋亡实验用于评价体外药效。结果：类脂质载体Staramine经TLC、FT-IR、1H-NMR等手段验证产物合成，经1H-NMR计算纯度为87%，DSPE-PEG2000-Mal经TLC和1H-NMR手段验证产物合成，经1H-NMR计算纯度为86.2%。Westernblot法筛选出最高沉默效率为38.40%的Survivin-siRNA链的。所制备的Staramine修饰的阳离子脂质体平均粒径为(172.7±6.6)nm、Zeta-电位为(+7.78±0.5)mV、包封率为（90.8±0.8）%，粒度均一，且对RNase酶有较好的保护作用。原子力显微镜观察A549/DDP细胞通过内吞作用摄取脂质体，流式细胞仪结果表明，EGFR靶向显著性（p＜0.05）提高细胞摄取，其平均荧光强度是EGFR未修饰的1.4倍。摄取机制结果表明，细胞摄取脂质体是一个能量依赖的过程，主要通过网格蛋白以及小窝蛋白介导的内吞。细胞凋亡的实验结果表明，EGFR-PEG-SCLs-siRNA组的凋亡率为（41.19±1.83）%，明显高于Lipofectamine-2000组的（21.03±1.37）%。结论：本文制备的EGFR靶向负载Survivin-siRNA的Staramine修饰的阳离子脂质体(EGFR-PEG-SCLs-siRNA)粒径均一稳定，EGFR靶向显著提高细胞摄取率。网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞为主要内吞途径。它能很好地转运siRNA,发挥Survivin-siRNA的体外促凋亡作用。
【作者】林莹；
【导师】崔京浩；
【作者基本信息】苏州大学，药学（专业学位），2014，硕士
【关键词】Survivin-siRNA；阳离子脂质体；细胞摄取；

【参考文献】
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