青藏高原一年生野生大麦耐铝毒机制的研究

【摘要】土壤酸化是全球普遍存在的农业生产问题,铝毒是酸性土壤限制作物生产的主要因子之一,克服酸害铝毒等土壤障碍因子是最大程度利用酸性土壤资源的关键所在。大麦(HordeumvulgareL.)是世界第四大谷类作物,其耐酸铝性明显低于其它禾本科作物,酸铝胁迫显著限制了大麦在酸性土壤的种植。培育耐酸铝品种,是提高酸土中大麦产量既经济又高效的途径；而发掘特异耐铝大麦种质,明确其耐性机制是培育耐铝大麦品种和制订耐酸铝栽培措施的基础。西藏野生大麦(以下称西藏野生大麦)为我国独有的珍贵野生资源,蕴藏着多种抗逆特异基因,为作物的遗传改良提供了丰富的基因库。本研究在筛选鉴定耐铝性不同西藏野生大麦基因型(H.vulgaresubsp.spontaneum)的基础上,以国际公认耐铝大麦品种Dayton为对照,研究了野生大麦耐/抗铝胁迫的生理与分子机制,同时,探讨了磷营养对大麦耐铝性影响的基因型差异,主要研究结果如下：1.西藏野生大麦耐酸铝鉴定和耐性基因型筛选以105份西藏野生大麦和45份栽培大麦基因型为材料,以铝胁迫-根系苏木精染色后的根系再伸长量为指标,结合滤纸培养铝胁迫试验后植株生长综合系数,分析评估供试材料对铝毒的耐性。结果表明,根系再伸长量基因型间存在极显著差异,野生大麦基因型间变异系数在62.9-80.0%范围,多样性指数达4.35-4.45。进一步进行铝胁迫水培筛选试验,结果表明,与耐铝大麦品种Dayton相比,西藏野生大麦XZ16的SPAD值、株高、干重和分蘖数等受抑制最轻,而XZ61受铝毒害最为严重；铝胁迫反应的基因型差异趋势与前两个筛选试验结果一致。综合分析后筛选到耐铝西藏野生大麦基因型XZ16、XZ166、XZ113,以及铝敏感基因型XZ61、XZ45、XZ98。分析测定植株体内铝含量,结果显示耐铝大麦基因型根系与地上部的铝含量显著低于铝敏感基因型。2.铝胁迫对西藏野生大麦光合特性及铝吸收与分布的影响及基因型差异以筛选所得耐铝西藏野生大麦基因型XZ16和敏感基因型XZ61为材料,以耐铝品种Dayton为对照,水培不同铝浓度处理(25、50、100和200μMAl)及不同时间(0、0.5、3、6、12、24h)25μMAl(?)协迫试验,研究铝胁迫对大麦光合特性及铝吸收与分布的影响及基因型差异。结果表明,耐铝野生大麦XZ16根尖铝荧光强度、根系和地上部铝积累量低于XZ61和Dayton。100μMAl胁迫15d后对叶片光合和荧光参数的影响基因型间存在显著差异：100μMAl胁迫显著降低XZ61的PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、光合速率和气孔导度；显著增加XZ16光合速率、气孔导度和蒸腾速率；对Dayton无显著影响。3.铝胁迫对西藏野生大麦矿质元素含量及抗氧化系统影响的基因型差异水培铝胁迫及铝胁迫下添加阴离子通道抑制剂或蛋白合成抑制剂等试验,研究XZ16、XZ61和Dayton的矿质元素吸收、ATP酶活性、膜脂过氧化和抗氧化酶系统在大麦耐铝机制中的作用及基因型差异。结果表明,铝胁迫下,与XZ61和Dayton相比,XZ16根系与地上部积累较低的铝和MDA,同时保持了较高的P、S、Ca、Mg等矿质元素含量以及CAT和APX活性。在25-200μMA1胁迫24h后,或100μM胁迫0-15d,与XZ61相比,XZ16保持了相对较高的H+-ATP、Ca2+Mg2+-ATP和总-ATP酶活性。因此,铝胁迫下的XZ16可能通过提高其根系与地上部ATP酶活性,保持较高的矿质元素含量；维持较高的CAT和APX酶活性,预防和清除铝胁迫引起的ROS积累,从而缓解铝毒害。4.铝胁迫及外源柠檬酸对西藏野生大麦根系有机酸分泌影响的基因型差异铝胁迫下,根细胞与叶绿体的电镜观察结果显示,与XZ61和Dayton相比,耐铝野生大麦XZ16的铝毒害较轻,根细胞结构较为完整,叶绿体基质浓密,被膜清晰,基粒类囊体片层垛叠较为规则,没有出现大量的嗜锇颗粒。分析铝胁迫对根系分泌物的影响,发现XZ16比XZ61分泌更多的柠檬酸；阴离子通道抑制剂尼氟酸NIF显著抑制3个大麦基因型的柠檬酸分泌,而蛋白合成抑制剂环己酰亚胺CHM只抑制XZ16的柠檬酸分泌,对XZ61和Dayton无显著影响。铝胁迫培养液中添加50μM柠檬酸,显著降低地上部铝含量,缓解了铝胁迫对根系生长的抑制效应,提高根干重及根细胞膜完整性,其中对铝敏感基因型XZ61的缓解效果尤其明显；但是对于铝造成的地上部干重下降和叶绿体的损伤无显著影响。进一步分析ATP酶活性和柠檬酸分泌的相关性,发现铝胁迫后二者呈显著正相关,启示可能在大麦耐铝机制中协同发挥作用。5.铝胁迫对西藏野生大麦蛋白表达谱的影响及基因型差异利用比较蛋白质组学技术,探讨了铝胁迫对XZ16、XZ61和Dayton根系蛋白质表达谱的影响及基因型差异,鉴定到基因型差异表达的与XZ16耐铝相关的蛋白点44个,质谱分析鉴定出35个差异蛋白点。上述XZ16耐铝相关的蛋白分别属于能量、新陈代谢、蛋白质储存、信号转导、细胞生长和分裂相关蛋白、蛋白合成、抗病与防御等。其中,30个蛋白的相关基因被定位到大麦染色体上；16个蛋白点在XZ16特异上调表达,并且其中的SAMS3、ATPsynthasebetasubunit、TPI和Bp2Aprotein仅在耐铝野生大麦XZ16中特异表达(Dayton中没有检测到这4个相关蛋白点),说明这些蛋白是XZ16的特异耐铝响应蛋白。6.铝胁迫对西藏野生大麦基因转录谱的影响及基因型差异利用基因芯片技术,分析比较了200Al胁迫下XZ16、XZ61和Dayton根系转录水平的表达差异,结果显示,铝胁迫显著影响大麦转录水平,基因型间存在显著差异；对3个大麦基因型铝胁迫下差异表达基因比对分析(200μMAl处理vs对照),筛选出野生大麦XZ16耐铝胁迫相关候选基因1251个,其中XZ16上调、XZ61下调表达15个,XZ16上调表达、XZ61不变682个,XZ16不变、XZ61下调表达553个。通过对已知基因的GO分析,发现这些基因参与了ABA、Ca2+、水杨酸、赤霉素、茉莉酸和乙烯等信号因子的调控,进而促进了转录水平、抗氧化、转运、碳水化合物代谢、脂肪代谢和保护系统等相关基因的上调表达,实现了铝胁迫下的DNA修复和蛋白合成、细胞内的离子平衡维持、ROS活性氧去除、糖酵解过程、ATP和乙酰辅酶A生成、TCA循环生成柠檬酸、促进细胞壁合成和生长等一系列功能的有效进行,从而响应XZ16的耐铝机制,再次证明了XZ16的耐铝机制不仅限于柠檬酸分泌,还与抗氧化酶活性、ABC转运蛋白、不同类型的ATP酶活性以及与TCA循环相关的其它基因的表达密切相关。7.磷营养对铝胁迫大麦生长的影响及基因型差异研究了不同浓度磷对铝胁迫下不同耐铝西藏野生大麦XZ16和XZ61,以及栽培大麦Dayton缓解效应的基因型差异。结果表明,与低磷对照(90μM)相比,高浓度磷(360μM)虽然增加了铝胁迫下敏感基因型XZ61根与地上部干重,但其干物质重下降值仍然大于XZ16和Dayton。同时,相对于XZ61,高浓度磷对铝胁迫下耐铝基因型XZ16缓解效果显著：气孔导度和蒸腾速率增加,根系APX和H+-ATP酶活性提高,叶片MDA积累降低,地上部铝含量减少,根系或地上部P、Mg、Ca、Fe等矿质元素含量提高,柠檬酸分泌增加。高浓度磷对铝胁迫的缓解效应依此为：XZ16>Dayton>XZ61。同时发现,高浓度磷对铝胁迫下XZ61和Dayton根系与地上部、以及XZ16根系的铝含量没有影响,但XZ16地上部铝含量显著减少。
【作者】戴华鑫；
【导师】邬飞波；
【作者基本信息】浙江大学，作物学，2013，博士
【关键词】野生大麦(H.Spontaneum)；铝胁迫；吸收与定位；基因型差异；蛋白组学；基因芯片；磷铝互作；ATP酶；有机酸分泌；活性氧代谢；矿质元素；

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