SUR2B/Kir6.1通道开放剂埃他卡林与高血压药物联用降压作用特征和纳他卡林对充血性心力衰竭的改善作用的研究

【摘要】由于发病率高、死亡率高、致残率高，心血管疾病是严重危害人类健康的头号杀手。内皮细胞功能紊乱是众多心血管疾病发生发展的病理基础，是心血管疾病的独立危险因子，在高血压、充血性心力衰竭的发生发展中起着非常重要的作用，但一直以来在血管内皮细胞上未发现合适的作用靶标。ATP敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassiumchannel,KATP)是受细胞内ATP浓度调控的一种内向整流钾通道，分布在心脏、平滑肌细胞、内皮细胞、脑、肾、胰腺等诸多组织和器官上。KATP是目前所知的唯一的一个将细胞的代谢状态和和细胞膜电位偶联的离子通道。在生理条件下KATP通道基本处于关闭状态。当细胞发生缺血、缺氧，能量消耗时通道开放，开放的KATP通过影响细胞的兴奋性而参与细胞诸多功能的调节。因此，KATP在众多心血管系统疾病如高血压、心肌缺血和心力衰竭等疾病的病理生理学过程中发挥着重要的作用，成为治疗心血管疾病的新的作用靶点。KATP由内向整流钾通道(inwardrectifierpotassiumchannel,Kir)和硫脲类受体(sulfonylureareceptor,SUR)两部分组成，前者形成离子通道，后者决定着KATP的功能，Kir和SUR按1∶1比例组成的异源性八聚体(SUR/Kir6.x)4[59]。众多研究表明胰腺细胞膜上的KATP为SUR1/Kir6.2，心肌细胞膜上的KATP为SUR2A/Kir6.2，平滑肌细胞上的KATP为SUR2B/Kir6.x，内皮细胞上的KATP为SUR2B/Kir6.1。2007年我室提出一个新观点，即：选择性激活内皮细胞上的SUR2B/Kir6.1KATP亚基能够纠正内皮细胞功能紊乱，恢复内皮功能。埃他卡林(iptakalim,Ipt)和其衍生物纳他卡林(natakalim,Nat)都是全新结构类型ATP敏感性钾通道开放剂，能够靶向激活SUR2B/Kir6.1亚型。Ipt作为抗高血压药物已经完成三期临床试验，具有确切、平稳和持久的抗高血压作用；对心率影响很小，无严重不良事件发生，安全性较好；对高血压靶器官心、脑、肾损伤具有保护作用。Nat作为抗充血性心力衰竭药物已经开展了系统的临床前研究，前期研究证明能够逆转腹主动脉缩窄致压力超负荷动物模型的心室重构、阻止心室重构向心力衰竭的发生发展。本课题从埃他卡林与临床一线抗高血压药物联合降压作用特征和纳他卡林改善充血性心力衰竭作用去研究新型ATP敏感性钾通道开放剂的药理学作用特征。第一部分埃他卡林与临床一线高血压药物联用心血管效应的特征高血压的发病率正在全球呈直线上升趋势，成为全球首位导致死亡的危险因素。中国高血压人数已达2亿，但是人群高血压治疗率和控制率很低，仅为38.5%和9.5%，我国正成为世界上高血压危害最严重的国家之一。高血压是最常见的慢性病，也是心脑血管病最主要的危险因素，脑卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病是其主要并发症。目前研究认为最大程度取得治疗高血压的疗效，要求更大程度的降低血压，而做到这一点单药治疗常力不能及，大部分病人需要两种或两种以上的不同种类的降压药物才能将血压降到这一目标。研究表明，单一药物能够达到控制目的的高血压患者只有29%，44%的高血压患者需两种降压药联合应用，27%的高血压患者需要三种及其三种以上药物联合应用才能达到控制目的。埃他卡林(iptakalim,Ipt)是一个全新结构类型ATP敏感性钾通道开放剂，靶向SUR2B/Kir6.1亚型，选择性作用于中小动脉。动物实验和临床试验表明其具有确切、平稳和持久的抗高血压作用，对心率影响很小，无严重不良事件发生，安全性较好。Ipt作为一种新型抗高血压药物即将上市，为新药审批的需要，同时也为临床开发新的联合降压治疗方案提供药理学基础，研究Ipt与利尿剂、钙拮抗剂、受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂等4类临床一线抗血压药物联合用药的特点势在必行。本课题采用析因设计在麻醉正常大鼠模型上观察低剂量Ipt与利尿剂、钙拮抗剂、受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂等4类抗高血压药物的代表药物苯磺酸氨氯地平(amlodipinebesylate,Aml)、赖诺普利(lisenopril,Lis)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide,Hyd)和普萘洛尔(propranolol,Pro)联合用药的心血管效应。实验结果：Ipt单独使用小剂量即可产生明显的降压作用。析因设计分析表明：Ipt和Aml联合应用对HR降低幅度的影响有交互作用(P<0.05)，对SBP、DBP、MABP降低幅度的影响无交互作用(P>0.05)但有相加作用，对LVSP降低和LVEDP升高幅度的影响无交互作用(P>0.05)；Ipt和Lis联合应用对SBP、DBP、MABP、与LVSP降低和LVEDP升高幅度的影响有交互作用(P<0.05)，对HR降低幅度的影响无交互作用(P>0.05)；Ipt和Hyd联合应用对DBP、MABP与LVSP降低和LVEDP升高幅度的影响有交互作用(P<0.05)，对SBP、HR降低幅度的影响无交互作用(P>0.05)；Ipt和Pro联合应用对DBP和MABP降低幅度的影响有交互作用(P<0.05)，对HR、SBP、LVSP降低和LVEDP升高幅度的影响无交互作用(P>0.05)。第二部分纳他卡林改善充血性心力衰竭的药理学作用充血性心力衰竭(congestiveheartfailure,CHF)是临床上极为常见的危重病症，是多数心脏病患者不可避免的最终结局，其发病率高，存活率低。流行病学统计表明目前我国大约有400万心衰患者，患病率为0.9%，其中老年人患病率为1.3%，并且在40年内，心衰的死亡率增加了6倍。现有的治疗CHF的药物的作用靶点主要集中在心脏和平滑肌上，不良反应多，有些长期服用甚至可使病死率增加。因此寻找治疗CHF新的治疗靶点，开发防止心血管重构、保护靶器官、提高患者生活质量的新型药物意义重大。我室前期实验证明纳他卡林对低氧和同型半胱氨酸损伤的主动脉内皮细胞具有保护作用，也能够逆转腹主动脉缩窄致压力超负荷动物模型的心室重构、阻止心室重构向心力衰竭的发生发展，机制与其选择性激活SUR2B/Kir6.1KATP亚基，纠正内皮功能紊乱、保护内皮功能有关。我们利用结扎大鼠左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死后大鼠充血性心力衰竭模型来观察纳他卡林对急性心肌梗死诱导心室重构、充血性心力衰竭的防治作用并探讨其作用机制。实验结果：1.冠状动脉左前降支结扎对大鼠的影响冠状动脉左前降支结扎8W后，模型组大鼠收缩压、舒张压、平均动脉压显著下降(P<0.01)；而模型组大鼠的心率只降低了3.2%(P＞0.05)，没有统计学意义。检测血流动力学指标发现，与假手术组相比，模型组大鼠LVBP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、Vmp和Vmax显著降低(P<0.01)，而LVEDP升高(P<0.01)，说明模型组大鼠心脏收缩功能和舒张功能严重受损。冠状动脉左前降支结扎8W后，与假手术组相比，模型组大鼠全心重量指数、左心重量指数明显增加了(P<0.05,P<0.01)。HE染色结果显示，模型组大鼠心肌纤维排列增粗、紊乱，甚至断裂，心肌细胞肥大，心肌间质显著增生，炎细胞浸润；心肌细胞横截面积显著增大，比假手术组增加了212%(P<0.01)。超微电镜结果显示，模型组大鼠心肌肌丝增粗，肌原纤维结构破坏、排列紊乱、断裂，局部肌纤维溶解散在的肌纤维有小灶性溶解；润盘扭曲，生长紊乱；心肌肌膜局部溶解、水肿；Z线扭曲、变形，形成大量肌溶灶；线粒体数目明显减少，有的线粒体灶性溶解，部分线粒体膜破坏缺失，明显空泡化，嵴稀疏破坏。说明冠状动脉左前降支结扎8W后，心脏代偿性肥大，心肌组织严重受损。Masson染色结果显示，模型组胶原含量比假手术组显著增加(P<0.01)；心肌组织羟脯氨酸检测发现，模型组羟脯氨酸含量比假手术组显著增加(P<0.01)。说明冠状动脉左前降支结扎8W后，心脏纤维化显著。心肌梗死大鼠从心室重构过渡到心力衰竭的标志是右心肥大、肺充血、心功能下降及心衰指示因子ANP和BNP的过表达。冠状动脉左前降支结扎8W后，与假手术组相比，模型组大鼠右心室显著肥大。模型组大鼠肺充血明显，肺重量指数显著增加。Real-timePCR结果发现，模型组大鼠ANPmRNA和BNPmRNA过表达量。以上结果表明，左冠状动脉前降支结扎8周，大鼠血压显著降低、左心室的收缩和舒张功能严重受损；心脏明显增大、左心重量指数、右心重量指数和全心重量指数明显增加；心肌组织病理显示心肌受损严重、心肌细胞横截面显著增加、心肌纤维化明显；肺充血明显，肺重量指数增加；左室心肌组织心衰指示因子ANP和BNP的mRNA表达显著增加，结果显示模型组大鼠出现了左心室重构，并且心功能失代偿，证明心肌梗死诱导充血性心力衰竭模型建立成功。2.纳他卡林对心肌梗死后充血性心力衰竭大鼠的保护作用及其特征纳他卡林能够恢复心肌梗死大鼠降低的收缩压、舒张压、平均动脉压到正常(P<0.01versusMIgroup)，对大鼠的心率都没有明显影响(P＞0.05versusMIgroup)。纳他卡林1,3,9mg/kg/d能够升高心肌梗死大鼠降低的LVSP、+dp/dtmax、Vpm、Vmax、与-dp/dtmax(P<0.01versusMIgroup)，降低心肌梗死大鼠升高了的LVEDP(P<0.01versusMIgroup)，改善心脏收缩功能和舒张功能。纳他卡林1,3,9mg/kg/d能够逆转心肌梗死大鼠的心肌肥厚，降低全心重量指数、左心重量指数。纳他卡林1,3,9mg/kg/d能够剂量依赖性改善心肌梗死大鼠心肌组织病理变化，减小了心肌细胞的横截面积(P<0.01,P<0.01,P<0.01,versusMIgroup)。纳他卡林改善心肌梗死大鼠心肌组织的超微结构：肌纤维排列紧密，肌束间无大间隙；肌膜下无水肿；线粒体完整，嵴清晰。Masson染色结果显示，纳他卡林1,3,9mg/kg/d治疗8W，心肌梗死大鼠心肌组织胶原含量显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01versusMIgroup)；羟脯氨酸含量也显著降低(P＞0.05,P<0.05,P<0.05versusMIgroup)，说明纳他卡林能够降少心肌梗死大鼠心肌胶原纤维的增生，减轻心肌纤维化，对心肌梗死诱导充血性心力衰竭大鼠的心肌胶原沉积有明显的改善作用。纳他卡林1,3,9mg/kg/d能够逆转大鼠心肌梗死大鼠右心室肥厚，降低右心重量指数(P<0.05,P<0.05,P<0.05vsMIgroup)。纳他卡林1,3,9mg/kg/d能够逆转心肌梗死大鼠肺充血，降低肺重量指数(P<0.05,P<0.01,P<0.01vsMIgroup)。Realtime-PCR结果显示，纳他卡林1,3,9mg/kg/d显著降低心肌梗死大鼠ANPmRNA(P<0.05,P<0.05,P<0.05vsMIgroup)和BNPmRNA的表达(P＞0.05,P<0.05,P<0.05vsMIgroup)。以上结果表明纳他卡林能够逆转心肌梗死大鼠心肌肥厚、减轻心肌纤维化、改善心肌组织病理损伤；能够减轻肺充血、逆转右室肥大、降低心衰指示因子ANP和BNP的mRNA表达；能够改善心脏的收缩和舒张功能、恢复降低了的血压。提示，纳他卡林能够逆转心肌梗死大鼠的心室重构，对心肌梗死后大鼠的心力衰竭有防治作用，因此我们又做了相应内皮机制的探讨。3.纳他卡林防治心肌梗死后充血性心力衰竭大鼠内皮保护机制3.1.纳他卡林对心肌梗死后充血性心力衰竭大鼠内皮素系统的影响冠状动脉左前降支结扎8W后，模型组大鼠血浆ET-1含量比假手术组显著增加(P<0.01)。纳他卡林1,3,和9mg/kg/d治疗8W，能够剂量依赖性降低心肌梗死大鼠血浆ET-1含量(P＞0.05,P<0.05,P<0.01vsMIgroup)。免疫组化结果显示，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠心肌组织ETA蛋白表达量显著增加(P<0.01vsShamgroup)。纳他卡林1,3,9mg/kg/d治疗能够纠正心肌梗死大鼠ETA蛋白过表达(P<0.01,P<0.01,P<0.01vsMIgroup)。与假手术组大鼠相比，模型组大鼠心肌组织ETB蛋白表达量显著增加(P<0.01vsShamgroup)。纳他卡林1,3,9mg/kg/d治疗能够纠正心肌梗死大鼠ETB蛋白过表达(P<0.05,P<0.01,P<0.01vsMIgroup)。3.2.纳他卡林对心肌梗死后充血性心力衰竭大鼠一氧化氮/一氧化氮合酶的影响冠状动脉左前降支结扎8W后，与假手术组相比，模型组大鼠血清NO含量显著增加(P<0.01)。纳他卡林1,3,和9mg/kg/d治疗能够降低心肌梗死大鼠血清NO含量(P<0.01,P<0.01,P<0.01vsMIgroup)。Westernblot结果显示，假手术组大鼠心肌组织eNOS蛋白表达量很高，而模型组大鼠eNOS蛋白表达量显著降低了65.2%(P<0.01vsShamgroup)；纳他卡林1,3,9mg/kg/d治疗能够升高心肌梗死大鼠心肌组织eNOS蛋白表达量(P＞0.05,P<0.05,P<0.01vsMIgroup)。模型组大鼠心肌组织iNOS蛋白表达量升高(P<0.01vsShamgroup)。纳他卡林1,3,9mg/kg/d治疗显著降低心肌梗死大鼠心肌组织iNOS蛋白表达量(P＞0.05,P<0.05,P<0.01vsMIgroup)。3.3纳他卡林对心肌梗死诱导充血性心力衰竭大鼠PGI2和TXA2平衡的影响PGI2的性质不稳定，半衰期约3分钟，迅速分解为6-酮-前列腺素F1a(6-keto-PGF1a)，因此常测定6-keto-PGF1a来反映血浆中PGI2的水平。与假手术组相比，模型组大鼠血浆6-keto-PGF1a含量显著降低(P<0.01)。纳他卡林3,9mg/kg/d治疗能够升高心肌梗死大鼠血浆6-keto-PGF1a含量(P＞0.05,P<0.05vsMIgroup)。TXA2半衰期只有30秒，很快降解为TXB2，因此常测定TXB2来反映血浆中TXA2的水平。与假手术组相比，模型组大鼠血浆TXB2含量显著升高(P<0.01)，升高了95.8%。纳他卡林1,3和9mg/kg/d治疗8W，能够剂量依赖性降低心肌梗死大鼠血浆TXB2含量(P<0.05,P<0.01,P<0.01vsMIgroup)。结论：1.本研究证实新型ATP敏感性钾通道开放剂埃他卡林与目前临床上应用的不同作用机制的临床一线抗高血压药物：血管紧张素Ⅰ转换酶抑制剂—赖诺普利、噻嗪类利尿剂—氢氯噻嗪和β受体阻断剂—普萘洛尔分别联合用药都有显著地协同降压作用，与二氢吡啶类钙拮抗剂—氨氯地平联合用药产生相加的降压作用，为埃他卡林进入临床后开发新的联合降压治疗方案提供了药理学理论依据。2．本研究在左冠状动脉前降支结扎大鼠模型证实纳他卡林能够逆转心室重构、改善受损的心室功能、阻止充血性心力衰竭的发生、对心肌梗死后大鼠的心力衰竭具有防治作用，这种防治作用纠正心肌梗死大鼠内皮功能紊乱、恢复内皮功能有关。本研究提示纠正内皮功能紊乱是充血性心力衰竭一个新的治疗策略，纳他卡林很可能会成为临床上治疗充血性心力衰竭非常有效的药物，有进一步开发的前景。
【作者】周红敏；
【导师】汪海；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，药理学，2014，博士
【关键词】埃他卡林；高血压；联合用药；纳他卡林；充血性心力衰竭；内皮功能；

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