氮肥对油菜籽维生素E形成的影响及BnaX.VTE4.b单碱基突变(SNP)与alpha-/gamma-生育酚比值之间的相关性研究

【摘要】油菜是温带气候区最重要的油料作物,是人类食用油的主要来源之一,并可以被用作动物饲料以及工业原料。菜籽油中所含的维生素E(生育酚),具有抗氧化和清除自由基的功能,对人体有很高的营养价值。生育酚包含四种同分异构体(a,p,丫和δ型生育酚),其中γ型生育酚含量最高,其次是活性最高的a型生育酚。因此,油菜籽中生育酚含量与组分的改良是油菜育种的目标之一。然而,对油菜种子中维生素E合成和积累还缺少更为深入的研究,运用气相色谱方法检测油菜籽中维生素E含量和组分的方法依旧存在着缺陷和不足。本研究旨在：(1)改进提取和检测油菜籽中维生素E含量的技术方法；(2)探索不同氮源和施用量的氮肥对油菜籽中维生素E合成的影响；(3)解析BnaX.VTE4.b基因上的单碱基突变(singlenucleotidepolymorphism,简称SNP)与维生素E含量及α-/γ-生育酚比值的关系。主要研究工作及结果概括如下：气相色谱分析法在脂肪酸分析方面已很成熟,但是在油菜籽粒维生素E检测上缺乏相应的参考资料和数据。本研究用三种不同的维生素E浸提方法(P1,P2,andP3)测定了高油605、浙619、,浙双758、和浙双72四个品种油菜籽中维生素E的含量。其中,P1为浸提后对溶剂进行蒸发,省去甲硅烷基化的步骤；P2为过夜提取后直接进行上清液的收集,不需要干燥与甲硅烷基化；P3则使用三甲基硅烷基三氟乙酰胺进行三甲硅烷基化作用。实验结果表明,用P3方法提取的油菜籽粒维生素E是最适合进一步用气相色谱方法加以分析。通过对多个不同品种油菜的维生素E含量分析表明,对中国各种不同种质油菜中维生素E的全面的定量分析十分必要,这将有利于进一步开展油菜品质育种。氮肥是植物不可缺少的肥料成分,对提高生物量和作物产量具有重要作用。然而,氮肥的种类和施用量对种子中维生素E含量的影响却缺乏相关性的研究和数据。本研究将两种氮肥(尿素和硝酸铵)分别施用于盆栽的五个不同油菜品种中,设三个水平的氮肥施用量：0.41克／盆(N1)；0.81克／盆(N2)；and1.20克/盆(N3)。实验结果显示,相对于硝酸铵,以尿素作为氮源的油菜种子中a-维生素E,γ-生素E以及总维生素E含量都显著地较高的,其中又以N3最为显著。维生素E组分分析表明a-维生素E和γ-维生素E的比值与维生素E总含量存在显著的相关性。因此,不同的氮源和施用量能够显著的影响油菜种子中维生素E的组分和含量。单碱基突变(SNP)是分析导致某一性状表现型变化的有效分子标记。在这项研究的第三部分,高分辨率融解曲线(HighResolutionMelting,简称HRM)技术被用于检测维生素E合成途径上控制α-/γ-生育酚比值的BnaX.VTE4.b基因,在1011个EMS诱变二代单株DNA间的SNP多态性,检测到的SNP进一步用于菜籽α-/γ-生育酚比值变化的关联分析。研究发现：(1)EMS诱变二代单株之间无论籽粒维生素E的总含量与a-/γ-生育酚比值变化幅度都很大,维生素E的总含量的变化范围在150.33-424.18mg/k,均值为293.39±4.23；a-/γ-生育酚比值的变化范围为0.35-2.84,均值0.9±0.37。(2)Real-TimePCR基础上的HRM技术可以高效地检测到大量的SNP标记,但是在BnaX.VTE4.b基因不同区域上SNP的发生频率不同,靠近5撇端SNP发生频率显著地高于其他区域。(3)在连锁不平衡分析基础上的关联分析显示,部分SNP标记与籽粒α-/γ-生育酚比值具有显著的关联性,这些标记对于以改进籽粒维生素E品质为目标的分子育种具有很高的应用价值。以上研究进一步拓展了人们对油菜种子中维生素E形成机制的认识与理解,并为油菜维生素E品质育种提供了一种高效的检测方法。
【作者】NAZIMHUSSAIN；
【导师】蒋立希；
【作者基本信息】浙江大学，作物学，2013，博士
【关键词】甘蓝型油菜；基因型变异；维生素E分析；气相色谱分析；原子吸收；氮；农艺性状；甲磺酸乙酯；高分辨率熔解曲线；

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