乳酸菌生物转化共轭亚油酸的研究

【摘要】共轭亚油酸(Conjugatedlinoleicacid，CLA)是多种含有共轭双键十八碳二烯酸的总称，因具有多种生理功能而受到广泛关注。近年来越来越多文献报道了包括丁酸弧菌、丙酸杆菌、乳杆菌、双歧杆菌等在内的多种细菌可生物转化CLA。相比于已研究较成熟并完成晶体结构解析的痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶(Linoleateisomerase)，乳酸菌中实现CLA生物转化的亚油酸异构酶仍没有定论。为了探究乳酸菌生物转化CLA的机制及生物转化CLA差异的原因，我们首先对88株乳酸菌进行了筛选并得到一批高产CLA的菌株。其次研究了六株乳酸菌中存在的推测乳酸菌亚油酸异构酶的功能，并对生物转化CLA的植物乳杆菌ZS2058完成全基因组测序及生物转化CLA机制的验证。最后利用生物信息学方法对乳酸菌中亚油酸异构酶系基因的分布情况进行比较分析，对不能生物转化CLA的植物乳杆菌ST-III中的亚油酸异构酶系进行功能验证，并对七株含有亚油酸异构酶系基因但生物转化CLA能力有显著差异的乳酸菌进行分析，以阐明乳酸菌生物转化CLA差异的内在原因。论文的主要研究结果如下：(1)对多种来源、多个种属的乳酸菌在添加亚油酸的培养基中生长后发酵液及菌体的脂肪酸组成进行分析以筛选生物转化CLA菌株。结果显示所有分析的88株乳酸菌均不同程度地将亚油酸代谢至10-羟基-顺12-十八碳烯酸(10-HOE)。植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和动物双歧杆菌等共计17株乳酸菌具有良好的生物转化CLA的能力。植物乳杆菌ZS2058、植物乳杆菌CCFM47、植物乳杆菌CCFM232、保加利亚乳杆菌CCFM4等可将超过30%的亚油酸转化为c9，t11-CLA和t9，t11-CLA。首次发现保加利亚乳杆菌CCFM29、植物乳杆菌CCFM169、植物乳杆菌CCFM176等21株乳酸菌在生物转化CLA时，油酸含量显著增加。(2)生物信息学综合分析显示植物乳杆菌ZS2058、动物双歧杆菌BB-12、植物乳杆菌ST-III、鼠李糖乳杆菌LGG、干酪乳杆菌Zhang和嗜酸乳杆菌NCFM六株乳酸菌中肌球蛋白交叉反应抗原(MCRA)与推测的乳酸菌亚油酸异构酶具有较高的同源性。在大肠杆菌中重组表达并纯化蛋白及功能检验结果表明，这六个MCRA蛋白均为(亚)油酸水合酶，而非亚油酸异构酶，仅将亚油酸转化为10-HOE，将油酸转化为10-羟基-十八碳酸(10-HO)。结合这六株乳酸菌积累10-HOE的实际情况，可初步认为MCRA蛋白可能是乳酸菌生物转化CLA的亚油酸异构酶(系)中的一个组成。(3)对植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA时中间产物积累的分析结果显示，在其生物转化CLA时积累的中间产物是：10-HOE，10-氧代-顺12-十八碳烯酸，10-氧代-反11-十八碳烯酸，10-氧代-十八碳酸。对植物乳杆菌ZS2058进行了全基因组测序及注释，并分析得到推测的亚油酸异构酶系，包括(亚)油酸水合酶、短链脱氢酶/氧化还原酶、乙酰乙酸脱羧酶，其中的(亚)油酸水合酶即为MCRA。利用大肠杆菌表达系统分别异源表达了亚油酸异构酶系的各组分并对各自催化的产物进行检测，结果显示(亚)油酸水合酶催化亚油酸转化为10-HOE，短链脱氢酶/氧化还原酶催化10-HOE转化为10-氧代-顺12-十八碳烯酸，乙酰乙酸脱羧酶将10-氧代-顺12-十八碳烯酸转化为10-氧代-反11-十八碳烯酸，三个酶共同作用于亚油酸即可得c9，t11-CLA。因此，植物乳杆菌ZS2058生物转化CLA的机制可归纳为亚油酸在历经10-HOE、10-氧代-顺12-十八碳烯酸、10-氧代-反11-十八碳烯酸等多个中间产物后最终转化为CLA。(4)对不能生物转化CLA的植物乳杆菌ST-III与高效生物转化CLA的植物乳杆菌ZS2058进行全基因组比对发现，植物乳杆菌ST-III存在编码亚油酸异构酶系的基因(即亚油酸水合酶、短链脱氢酶/氧化还原酶、乙酰乙酸脱羧酶)。将这三个组成基因在大肠杆菌中分别重组表达后，GC-MS检测重组菌催化反应后的脂肪酸组成结果显示这三个酶依次可将亚油酸转化为10-HOE、10-氧代-顺12-十八碳烯酸、10-氧代-反11-十八碳烯酸，在三个酶的共同作用下亚油酸时被转化为CLA。因此，从基因组成和蛋白功能而言，植物乳杆菌ST-III理论上具备与植物乳杆菌ZS2058相似的生物转化CLA的能力，未表现出生物转化CLA的能力并非亚油酸异构酶系活性不完整所造成。(5)通过生物信息学方法对所有公开基因组的乳酸菌进行了亚油酸异构酶系基因的分析，结果显示尽管存在方式有差异，但绝大多数乳酸菌含有完整了亚油酸异构酶系。对植物乳杆菌ZS2058、植物乳杆菌CCFM261、植物乳杆菌ST-III、罗伊氏乳杆菌ATCC55739、罗伊氏乳杆菌CCFM14、干酪乳杆菌Zhang和干酪乳杆菌BD-II在内的生物转化CLA能力有差异的七株乳酸菌中亚油酸异构酶系各组成基因的转录水平进行了分析，实时荧光定量PCR结果表明，亚油酸异构酶系中的短链脱氢酶/氧化还原酶、乙酰乙酸脱羧酶的转录水平差异是造成生物转化CLA能力不同的内在原因。
【作者】杨波；
【导师】张灏；
【作者基本信息】江南大学，食品科学，2014，博士
【关键词】乳酸菌；共轭亚油酸；亚油酸异构酶；重组表达；实时定量荧光PCR；

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