久效磷农药对虹鳟鱼性腺细胞系性激素生成途径的影响及其机制研究

【摘要】久效磷农药是联合国环境规划署优先控制污染物之一，已有研究证实久效磷农药对金鱼、斑马鱼等硬骨鱼具有雌激素效应，而扰乱鱼体内性激素含量是其发挥雌激素效应的关键。鱼类性激素的合成既受到其性激素生成途径中相关蛋白和酶类的影响也受到下丘脑-垂体-性腺轴中上游神经系统的调控。为了避免体内实验中来自内分泌轴线各个器官之间的作用，本文以虹鳟鱼性腺细胞系(RTG-2cells)为实验材料，研究久效磷农药暴露条件下细胞培养基中性激素的浓度和性激素生成相关蛋白和关键酶的表达水平，以说明久效磷农药是否能通过性激素生成途径影响性激素的合成；同时，从蛋白激酶A(PKA)/蛋白激酶C(PKC)两条信号途径在久效磷农药调控性激素生成相关基因表达中的作用以及久效磷农药暴露下胞内cAMP含量和PKA活性的变化两方面，研究久效磷农药对性激素生成相关基因表达的调控，从激素水平、基因表达和信号途径三个层次，探讨久效磷农药干扰性激素水平影响性激素生成途径的作用机制。本文研究结果表明：(1)久效磷农药对RTG-2细胞的48hIC50为243.80μg/L，当浓度小于160μg/L时，细胞的成活率不受久效磷农药的影响，通过对细胞内乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶三种酶活性的检测发现，所选择的久效磷农药暴露浓度对细胞生长没有影响。(2)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷农药暴露细胞48h，采用放射免疫分析法检测了培养基中性激素的含量，结果表明，对照组和0.1μg/L久效磷农药暴露组细胞培养基中雌激素(17β-estradiol,E2)含量低于培养基中雌激素的初始含量，而1.0和10.0μg/L久效磷农药暴露组细胞培养基中E2含量显著高于初始浓度和对照组浓度；久效磷农药各处理组培养基中睾酮浓度均低于培养基中睾酮的初始浓度，表明久效磷农药能够干扰RTG-2细胞的性激素合成，促进了RTG-2细胞合成分泌E2。(3)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷农药暴露细胞48h，采用荧光实时定量PCR(real-timePCR)的方法检测性激素生成相关的蛋白和关键酶的表达水平。结果表明，各浓度久效磷农药对性激素合成急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)的表达水平无影响，1.0和10.0μg/L久效磷农药使胆固醇侧链裂解酶(cholesterolsidechaincleavageenzyme,CYP11A1)和17α羟化酶(cytochromeP45017alpha-hydroxylase,CYP17)的表达增加，0.1、1.0和10.0μg/L久效磷农药促进了性腺芳香化酶P450(cytochromeP450aromatase,CYP19A)的转录表达，说明久效磷农药可以通过提高性激素生成相关基因的表达水平来影响性激素的合成。(4)基于前一部分研究，选择影响基因表达的10.0μg/L做为久效磷农药暴露浓度，同时设置PKA抑制剂和PKC抑制剂与久效磷农药联合暴露，暴露48h后，利用real-timePCR的方法检测StAR、CYP11A1、CYP17和CYP19A的表达。结果表明PKA抑制剂与久效磷农药联合暴露组，CYP11A1、CYP17和CYP19A的表达显著低于10.0μg/L久效磷农药暴露组，而PKC抑制剂对各基因的表达无影响，说明久效磷农药对各基因的表达调控是通过PKA途径进行的。(5)0.1、1.0、10.0、100.0μg/L久效磷农药暴露细胞，分别在暴露0.5h、2h、4h、8h、24h和48h取样，用酶联免疫分析的方法检测细胞内cAMP浓度随暴露时间和暴露浓度的变化，结果表明除1.0μg/L，其它浓度久效磷农药在暴露后4h内均使cAMP浓度上升；用非放射性检测系统检测久效磷农药暴露4h后PKA活性的变化，发现1.0、10.0和100.0μg/L久效磷农药使细胞内PKA活性增强，证明久效磷农药对cAMP/PKA途径具有促进作用。综上所述，本文从性激素含量、调控性激素合成的关键酶基因表达水平和调控基因表达的信号途径三个层次，研究了久效磷农药对性激素生成途径的干扰作用与机制，结果表明久效磷农药通过对cAMP/PKA信号途径的促进作用，提高了性激素生成关键酶基因的表达水平，最终使性激素的合成分泌增加。本文首次提出久效磷农药调控性激素生成相关基因是通过活化cAMP/PKA这一信号途径介导的，并通过对性激素生成关键酶基因的表达水平的影响来调控性激素的合成，这为与久效磷农药同类型不能与雌激素受体结合的雌激素效应化合物的作用机制研究提供了参考，也为久效磷农药发挥的多种毒性效应和其他内分泌扰乱作用提供了理论基础。
【作者】王真钰；
【导师】汝少国；田华；
【作者基本信息】中国海洋大学，生态学，2014，博士
【关键词】久效磷农药；性激素生成；cAMP/PKA信号途径；性激素生成相关酶；虹鳟鱼性腺细胞系；

【参考文献】
[1]赵兵.基于多传感器的移动机器人定位与轨迹跟踪技术研究[D].南京理工大学,机械电子工程,2013,硕士.
[2]韩涛.特别累犯问题研究[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[3]肖传晶.基于STC89C54的温室微喷灌控制系统的设计[D].内蒙古农业大学,农业工程,2013,硕士.
[4]张一帆.RNAi沉默SMC1A对肺癌A549及H1299细胞生长的抑制作用[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[5]梁赟.三氧化二砷诱导骨髓瘤细胞株凋亡及其机制的研究[D].浙江大学,内科学,2004,硕士.
[6]巩玮婧.原型理论和意象图式视角下的英语词汇教学[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[7]张晓瑛.班干部轮换制研究[D].内蒙古师范大学,教育管理（专业学位）,2012,硕士.
[8]林丽丽.侨乡留守儿童养成教育研究[D].温州大学,思想政治教育,2012,硕士.
[9]王静.死亡权问题研究[D].西南大学,伦理学,2013,硕士.
[10]魏星.电力系统机电波传播与控制研究[D].西南交通大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[11]刘辉.基于Petri网的面向服务软件体系结构描述语言[D].东北大学,计算机系统结构,2010,硕士.
[12]贺旭.三版本高中数学教材“微积分”内容比较与评价[D].华中师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[13]费莉雅.广西旅游业竞争力现状分析与对策探讨[D].广西大学,2003.
[14]张芳军.班轮航线设计与空箱调运的组合问题研究[D].北京交通大学,2015.
[15]马美丽.非英语专业大学生英语网络自主学习自我效能感研究[D].西南大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[16]戎澄,肖畅,段金娟.中性化设计的价值研究[J].艺术科技,2013,09:36+35.
[17]李建洋,兰添才.智能决策支持系统的体系结构研究[J].龙岩学院学报,2005,06:21-23.
[18]张弛.高压直流断路器及其关键技术[D].浙江大学,2014.
[19]李林虎.基于Linux系统的光缆识别仪的研制[D].北京交通大学,光通信与移动通信,2013,硕士.
[20]孙希发.钢桁拱桥结构特性分析与施工控制[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.
[21]任胜兵.基于图变换的可视化层次用例建模及演化方法研究[D].中南大学,2007.
[22]权娜娜.ZigBee车路通信平台设计和性能分析[D].长安大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[23]冯兵.公路正交异性钢桥面板构造细节的热点应力分析及疲劳研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[24]邓军.客户关系管理系统与商业银行发展[J].金融理论与实践,2002,12:26-27.
[25]何潮观.F-K数字滤波器的设计和应用[J].石油地球物理勘探,1985,05:474-489+511.
[26]董瑞翔.直读光谱仪微型机数据处理系统[J].冶金自动化,1983,02:57-58.
[27]夏波.供应链战略下的供应商管理及VMI应用[D].西南交通大学,工商管理,2003,硕士.
[28]陈珺.企业现代化管理系统的组成和功能[J].煤气与热力,2003,04:249-251.
[29]陈朋利.铅锌矿开采区铅锌混合接触对育龄妇女健康影响的研究[D].大理学院,流行病与卫生统计学,2013,硕士.
[30]孙敏.1-3型压电复合材料及换能器研究[D].济南大学,材料物理与化学,2012,硕士.
[31]牛令辉.TiO_2锂离子电池负极材料的制备及结构与电化学性能研究[D].浙江大学,材料学,2014,硕士.
[32]康瀚.黑腹果蝇种组Hsp23和Hsp27基因的分子系统学与内含子得失的相关研究[D].湖北大学,遗传学,2011,硕士.
[33]李大维.高速公路大粒径填石路堤修筑技术研究[D].重庆交通大学,道路与铁道工程,2012,硕士.
[34]李艳.基于WebGIS的土地资源信息系统研究[D].湖南大学,计算机应用技术,2010,硕士.
[35]刘杰,随星光.模糊聚类算法在Web使用挖掘中的应用[J].微型机与应用,2005,10:59-62.
[36]张涛.曲面烧蚀面积的测量及数据处理系统的研究[D].西安理工大学,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[37]姬志闯.“人”的失落与回归[D].河南大学,马克思主义哲学,2004,硕士.
[38]张莹.苯酚在典型矿物和沉积物上的吸附降解行为研究[D].辽宁大学,环境科学,2012,硕士.
[39]宋艳霞.阿诺德·伯林特审美理论研究[D].山东大学,文艺学,2014,博士.
[40]张江,李学伟.基于混沌边缘的决策行为分析[J].控制与决策,2005,10:1147-1151+1156.
[41]苏建林.我国竞技健美操教练员执教能力评价指标的构建研究[D].华东师范大学,体育教学,2012,硕士.
[42]薛珊燕.几种新型小分子荧光探针的合成及性能研究[D].湖南师范大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[43]李成江.多校区大学学生心理健康教育模式研究[D].河海大学,高等教育学,2004,硕士.
[44]李博.论《艾里甫与赛乃姆》剧中主要人物形象的演变[D].云南艺术学院,戏剧与影视学,2013,硕士.
[45]张志辉.电感耦合增强的单、双频容性耦合等离子体特性的研究[D].苏州大学,等离子体物理,2013,硕士.
[46]刘潇骁.SerDes电路的可测性集成设计与机台测试[D].国防科学技术大学,软件工程,2013,硕士.
[47]万勇,马廷灿,冯瑞华,姜山,黄健.国外石墨烯研发政策概览[J].新材料产业,2014,11:2-5.
[48]张梅.聚众斗殴罪的转化问题研究[D].沈阳师范大学,法律,2014,硕士.
[49]王玲.论当代英语词汇变迁中的创新性[D].江苏科技大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[50]封亮旗.血管抑素抑制兔角膜碱烧伤后新生血管的蛋白组研究[D].南方医科大学,眼科学,2012,硕士.