化痰法干预动脉粥样硬化机制的初步研究

【摘要】动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是多种临床心血管严重终末事件,如心肌梗死、脑梗塞、主动脉夹层等的始动因素。中国古代医籍中没有动脉粥样硬化的病名,多将其归属于“胸痹”、“真心痛”、“中风”、“眩晕”、“头痛”、“痴呆”、“痰饮”等病证。机体脏腑功能失调,脾胃运化功能减弱,加之饮食肥甘厚味,气机失畅,易化生为痰浊,痰浊流滞于血脉日久则成痰瘀交结之证,正虚邪实相互影响,致使病变不断发展。因此,中医学认为,动脉粥样硬化与痰瘀相关,以痰为主。化痰法治疗动脉粥样硬化应用广泛且疗效明确。黄连温胆汤作为代表性化痰方剂应用于动脉粥样硬化治疗。中医临床和实验研究提示黄连温胆汤可抑制动脉粥样硬化进程,减轻动脉粥样硬化病变,有显著抗动脉粥样硬化作用。动脉粥样硬化被定义为一种渐进性的,炎症性的疾病,以体内脂蛋白代谢紊乱,大中型动脉内膜的内皮细胞功能障碍/凋亡,白细胞和巨噬细胞的积累,浸润,形成斑块为特征。血液中的单核细胞在病变好发区与内皮表面粘附分子结合,在趋化因子作用下,进入内膜,然后转化为巨噬细胞,巨噬细胞经特异受体介导的胞吞作用蓄积脂质,启动巨噬细胞凋亡,同时分泌炎性因子,转变为泡沫细胞,形成脂质条纹。Ox-LDL同时促进炎症和巨噬细胞脂质摄取形成泡沫细胞,是AS进程的特征性病理之一。ApoE-/-小鼠即ApoE基因缺失小鼠,是动脉粥样硬化较为成熟理想的动物模型,5-6周龄时,电镜下即可见到在大动脉的内皮细胞表面有单核细胞的黏附。在同周龄小鼠中,电镜观察还发现了血浆单核细胞向血管内皮的迁移。生长到6-10周左右,大多数的apoE基因缺失小鼠会逐渐自发形成脂质条纹损伤,脂质条纹主要由泡沫细胞和向内增生的平滑肌细胞构成。TNF-α在动脉粥样硬化病变的发生、发展过程中发挥重要的作用；能够促进血管内皮细胞平滑肌细胞ICAM-1等粘附分子表达,刺激血管内皮细胞、成纤维细胞、单核／巨噬细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子,诱导炎症反应及平滑肌细胞的迁移增殖,促进AS炎症进程。炎性因子IL-10具有抗动脉粥样硬化作用。是巨噬细胞失活的有效刺激因子,从而抑制抗原提呈和炎症,延迟动脉粥样硬化炎性进程。本研究从体内和体外两方面研究,通过观察化痰法的代表方剂黄连温胆汤作用于ApoE基因敲除的动脉粥样硬化模型小鼠和THP-1源性巨噬细胞模型,对黄连温胆汤抑制AS的作用进行验证,并对黄连温胆汤抗AS的作用及作用机制进行初步探讨。深入研究以黄连温胆汤为代表的化痰法抗动脉粥样硬化作用的机制,对动脉粥样硬化治疗拓展新的治疗领域提供依据。实验研究第一章体内实验：黄连温胆汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响及作用机制目的探讨黄连温胆汤对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化水平的影响及机制。方法10周龄ApoE基因敲除小鼠27只,随机分为3组,分别为黄连温胆汤组(n=9)、模型组(n=9)和空白组(n=9)。模型组和黄连温胆汤组给予高脂饲料6周形成动脉粥样硬化模型后,给予黄连温胆汤组灌胃黄连温胆汤浓缩药物、模型组灌胃等量生理盐水8周；空白组喂食普通饲料6周后,继续灌胃生理盐水8周。14周后三组小鼠同时取材,测定血清血脂水平,TNF-α水平,心脏剥离后进行主动脉根部切片HE染色,甲苯胺蓝染色和免疫组化,测量主动脉斑块面积,蛋白聚糖沉积面积,统计斑块、蛋白聚糖沉积校正面积和蛋白聚糖／斑块校正面积,检测主动脉壁及斑块TNF-α蛋白表达量。结果1.与模型组相比较,黄连温胆汤组血脂水平下调；2.血清TNF-α水平和主动脉壁及斑块TNF-α蛋白表达水平明显下调;3.斑块绝对面积和校正面积显著缩小；4.蛋白聚糖沉积绝对面积减小,蛋白聚糖/斑块校正面积有上调趋势。结论黄连温胆汤具有降低血脂水平,减小主动脉斑块面积,抑制动脉粥样硬化病程进展的功效,该作用可能与降低炎性因子TNF-α水平和调节蛋白聚糖代谢相关。第二章体外实验：黄连温胆汤含药血清超滤组分对THP-1源性巨噬细胞活性及泡沫化的影响目的观察黄连温胆汤含药血清超滤组分对THP-1(人白血病单核细胞)源性巨噬细胞活性及其泡沫化的影响。方法THP-1以PMA(佛波酯)诱导为巨噬细胞,经ox-LDL(氧化低密度脂蛋白)处理建立动脉粥样硬化泡沫细胞模型；制备黄连温胆汤含药血清及空白血清经10KD超滤器超滤后,作用于泡沫细胞模型。MTT检测及油红染色观察对巨噬细胞存活率和泡沫化的影响；炎性因子定量分析液相芯片检测IL-10蛋白表达变化,流式细胞术检测对巨噬细胞凋亡率的影响。结果1.THP-1经100nmol/LPMA诱导24h后,与50μg/mL的ox-LDL共孵育24h,获得泡沫细胞模型。2.黄连温胆汤含药血清超滤成分作用于巨噬细胞,可明显提高巨噬细胞存活率,上调炎性因子IL-10蛋白表达,抑制泡沫化,降低凋亡率。结论黄连温胆汤抗动脉粥样硬化作用,可能与其抗巨噬细胞凋亡,降低巨噬细胞脂质吞噬作用相关。
【作者】燕珊；
【导师】陈群；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医诊断学，2014，博士
【关键词】化痰法；黄连温胆汤；ApoE；THP-1；

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