菊粉内切酶和蔗糖酶基因的高效重组表达及其在水解菊粉中的应用

【摘要】菊粉酶(Inulinase)是一种呋喃果糖基水解酶，它靶向作用于菊粉中的β-2,1糖苷键并将其水解为果糖和葡萄糖。菊粉酶可以分为菊粉外切酶和菊粉内切酶。菊粉外切酶可以从菊粉分子的非还原末端催化水解下β-D-呋喃果糖残基，其底物可为菊粉、蔗糖和果聚糖；菊粉内切酶可以水解菊粉内部的β-2,1糖苷键使其变成菊糖三糖、菊糖四糖和菊糖五糖为主的菊粉寡糖。蔗糖酶(Invertase)是一种β-呋喃果糖苷酶，它可以催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、高等植物和许多动物细胞中。其中，酒精酵母的蔗糖酶已被深入研究，并广泛应用于食品和发酵工业。酒精酵母的蔗糖酶主要是由SUC2基因编码的。本研究首先将节杆菌属Arthrobactersp.S37来源的菊粉内切酶基因EnIA在酵母菌解脂亚罗维亚中表达，并研究了重组菊粉内切酶的性质及水解菊粉的产物。将菊粉内切酶基因EnIA连接到表达质粒pINA1317上，在YarrowialipolyticaPo1h中进行分泌表达。重组转化子1317-EnIA生产的重组菊粉内切酶的酶活力和比活力大小分别为16.7U/mL和93.4U/mg，表观分子量大小为78.9kDa。重组酶的最适pH值为4.0，在pH2.0-8.0范围内，重组酶可以保持较高的活性。在40℃以下，重组酶有很好的稳定性，其最适作用温度为50℃。Li+离子对重组酶活性有激活作用。重组菊粉内切酶水解菊粉的主要产物为菊粉二糖。当把重组菊粉内切酶和菊粉外切酶混合水解菊粉时，混合物的菊粉酶活力大于两者菊粉酶相加之和，表现出协同作用。本实验室保藏的一株高产酒精酵母Saccharomycessp.W0菌株可以缓慢地糖化菊粉产生单糖，利用菊粉发酵生产少量的酒精。将菊粉内切酶基因EnIA在酒精酵母W0菌株中表达，提高W0菌株的菊粉酶活力和酒精产量。把菊粉内切酶基因EnIA连接到酒精酵母表达载体pMIDSC31（δ序列插入型）和pMIRSC31（rDNA序列插入型）上，整合到W0菌株的基因组DNA中。δ序列插入型重组转化子D5的菊粉酶活力高于rDNA序列插入型重组转化子R1。重组转化子D5的菊粉酶活力达8.6U/mL。在5-L发酵罐体系中，转化子D5以菊粉含量为30%（w/v）的培养基进行酒精发酵，酒精产量为13.6%（v/v,20℃）。转化子D5同步糖化生料菊芋粉，在1-L发酵体系中，酒精产量达10.1%（v/v,20℃）。W0菌株具有很低的菊粉酶活性，根据氨基酸序列的多重比对分析结果推测可能与蔗糖酶基因SUC2相关。蔗糖酶基因SUC2与酒精酵母具有菊粉酶活力可以发酵菊粉生产酒精之间的关系还鲜有报道。本研究将SUC2基因完全敲除并将原始SUC2基因在敲除菌株中超表达，根据敲除和超表达之后的实验结果解释蔗糖酶基因SUC2与W0菌株具有菊粉酶活性是否相关。蔗糖酶基因SUC2被敲除后，完全敲除菌株W4失去蔗糖酶和菊粉酶活力，不能在以蔗糖或菊粉为唯一碳源的培养基中正常生长，可以在以果糖为唯一碳源的培养基中生长。在敲除菌株W4中超表达蔗糖酶SUC2基因，超表达转化子SUC2-1的SUC2基因表达量为W0菌株的113.6倍，蔗糖酶和菊粉酶活力分别是W0菌株的2.53倍和6.60倍。SUC2基因超表达转化子水解菊粉的产物是单糖，可以利用30%（w/v）的菊粉发酵培养基生产13.4%（v/v,20℃）的酒精。在1-L发酵体系中，超表达转化子SUC2-1同步糖化生料菊芋粉的酒精产量达10.9%（v/v,20℃）。本实验首次证明W0菌株的SUC2基因与其胞外和胞内菊粉酶活性有关，也证明了在W0菌株中超表达蔗糖酶的技术也可应用到酒精发酵工业上。
【作者】李阳；
【导师】池振明；
【作者基本信息】中国海洋大学，微生物学，2014，博士
【关键词】菊粉内切酶；蔗糖酶；基因高效表达；SUC2基因；基因敲除；酒精发酵；

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