鸭坦布苏病毒生物学特性、基因组特征、诊断方法以及感染性克隆的研究

【摘要】鸭坦布苏病毒感染于2010年在我国首次爆发,迅速席卷了整个养鸭密集地区,给我国养鸭业造成了巨大损失,目前该病已成为我国主要鸭病之一。本研究从病毒的生物学特性、基因组测序与进化分析、实验室诊断方法的建立以及感染性克隆的构建等四个方面对鸭坦布苏病毒进行了相关研究。1、病毒分离鉴定与特性分析从全国各地发病的鸭群中分离到十多株鸭坦布苏病毒,通过理化特性分析,发现该病毒不能凝集鸡、鸭、鹅和鸽的红细胞,对氯仿和去氧胆酸钠敏感,对酸敏感,不耐热,MgCL2起不到保护作用。通过电镜观察,我们发现该病毒为圆形或椭圆形粒子,大小约为50nm。该病毒可通过鸡胚或鸭胚进行分离,胚体在72h～120h内死亡,胚体水肿,胚肝出血、坏死明显。该病毒在DEF、Vero、DF-1、BHK-21等细胞上生长良好、病变明显。不同毒株对CEF的适应性存在较大差异,有的毒株盲传3代就可适应CEF,而有的毒株盲传6代仍不适应。动物回归试验显示,通过脑内、颈部皮下和点眼滴鼻口服三种途径均能复制出该病典型的症状和病变,但这三种途径发病快慢有所差别,脑内接种最快,点眼滴鼻口服最慢。2、基因组测序与进化分析我们通过随机引物以及参考其他黄病毒设计的引物扩增得到鸭坦布苏病毒BZ-10株的全基因组序列,进而又完成了另外5株病毒基因组测序工作。通过对基因组的分析,我们发现6株病毒的基因组全长均为10990nt,包含一个长10278nt的阅读框(ORF),编码一个长3426aa的多聚蛋白,5’UTR长94nt,3’UTR长618nt,多聚蛋白包括10个蛋白,除了WFZ-12株外,其他5株病毒基因组均有17个糖基化位点,而WFZ-12株E蛋白的第154位氨基酸的糖基化位点缺失。通过对鸭坦布苏病毒的遗传进化分析,我们发现,该病毒与从马来西亚库蚊中分离到的Tembusuvirus口从发病肉鸡中分离到的Sitiawanvirus的遗传关系最近,同源性分别为88.7%和87.3%。通过对鸭坦布苏病毒E蛋白的空间结构进行模拟分析发现,该病毒E蛋白包括三个功能区,有两个糖基化位点,分别位于第103位和第154位氨基酸处,其中第103位糖基化位点在病毒复制和致病性方面可能起着重要的作用。大多数鸭坦布苏病毒E蛋白的第154位氨基酸处有个糖基化位点,但是WFZ-12株的第154位氨基酸未发生糖基化,而Tembusuvirus和Bagazavirus同样存在这种情况。这提示着,鸭坦布苏病毒在疾病进展过程中,它的一些感染机制可能正在发生着改变。通过进化树分析,我们发现鸭坦布苏病毒根据E基因可划分为Ⅰ、Ⅱ两个基因型,其中基因Ⅱ型又可细分为Ⅱ.a和Ⅱ.b两个亚型。有意思的是,基因Ⅰ型的毒株均为2010年分离,这似乎提示近两年该病毒有一定的变异。但分属于Ⅰ、Ⅱ.a和Ⅱ.b三个基因型的BZ-10、GX-11、FX-12这三株病毒的血清交叉中和试验显示,它们的中和指数都在0.9以上,这说明它们属于同一血清型,也就是说明这三株病毒虽然在基因型上有些许差异,但在抗原性上并没有发生变异。3、实验室诊断方法的建立针对病原检测,我们建立了RT-PCR和荧光定量PCR两种检测方法,临床应用表明,这两种方法都具有快速、准确、敏感性高、特异性好等优点,其中RT-PCR方法对病毒的最低检出毒价为1.0TCID50/0.1ml,而荧光定量PCR的最低检出毒价为0.1TCID50/0.1ml,敏感性更高。针对抗体检测,我们以原核表达的E蛋白作为包被抗原建立了高通量的间接ELISA检测方法,该方法的临界值为0.336,与血清中和试验的符合率为95.0%。4、感染性克隆的构建利用基因组内部的酶切位点作为连接位点,将基因组分为五个片段分别进行扩增,然后将这五个片段依次克隆入pBR322载体,得到BZ-10株基因组全长cDNA克隆。测序表明,该cDNA克隆与亲本毒的序列同源性达到99.9%,其中5’端和3’端非编码区完全一致,多聚蛋白的氨基酸序列也十分忠实。全长cDNA克隆体外转录出的RNA转染DF-1细胞,通过RT-PCR、间接免疫荧光试验和酶切鉴定,结果表明我们成功拯救到子代病毒BZ10-R。子代病毒在鸡胚尿囊液中的ELDso为104.6/0.2mL,在DF-1上的TCID50为105.3/0.2mL,与亲本毒的差别都不大。但是,由于我们在构建cDNA克隆时,选择了外源基因容量并不是很大的pBR322载体,最终得到cDNA克隆很不稳定,可能为后续的工作带来了困难。
【作者】于可响；
【导师】孙怀昌；
【作者基本信息】扬州大学，预防兽医学，2013，博士
【关键词】鸭坦布苏病毒；生物学特性；基因组分析；诊断方法；感染性克隆；

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