BEZ235抑制胰腺癌细胞迁移与浸润的机制及SIX1蛋白表达与胰腺癌临床特点关系的研究

【摘要】目的：胰腺癌以恶性程度高、发展快、预后差而闻名,在欧美国家列恶性肿瘤死亡率的第四位,在我国该病发病率及死亡率迅速上升,列恶性肿瘤死亡率的第六位,但其发病机制至今未明,治疗方面尚无突破性进展。因此,对胰腺癌分子生物学基础进行深入研究非常重要。本文研究PI3K/Akt的选择性抑制剂NVP-BEZ235(BEZ235)体外抑制胰腺癌细胞的作用及其分子机制,为胰腺癌的生物学治疗提供可能的分子靶点；同时研究SIX1蛋白表达在胰腺癌生物学行为判定中的临床意义。材料与方法：体外培养胰腺癌Panc-1细胞,并用不同浓度BEZ235刺激Panc-1细胞。首先应用MTT法检测BEZ235对Panc-1细胞的抑制作用；用倒置显微镜观察BEZ235对Panc-1细胞形态学的影响；用划痕、transwell等实验验证BEZ235对Panc-1细胞的迁移、浸润的影响；用AffymetrixGeneChip微阵列分析观察转移相关因子Ezrin和SIXl在Panc-1细胞中BEZ235处理前后异常表达；利用Westernblotting方法、免疫荧光法检测BEZ235处理前后迁移相关因子Ezrin蛋白的以及血管生成相关因子SIXl蛋白的表达及SIX1蛋白定位情况。另外,应用免疫组化方法检测了SIX1蛋白在103例胰腺癌组织以及45例正常胰腺组织中的表达,并分析了其临床意义。结果：1.BEZ235可抑制胰腺癌Panc-1细胞中的PI3K/Akt信号通路。应用梯度浓度BEZ235处理Panc-1细胞48小时后发现：与未处理组比较,p-Akt在50nM处理组开始表达下降,并呈现浓度依赖现象,提示BEZ235可以抑制Panc-1细胞中的PI3K/Akt信号通路。2.BEZ235可抑制Panc-1细胞增殖。MTT法检测结果表明BEZ235影响Panc-1细胞生存能力,在250rnM,500nM及1000nMBEZ235处理48h时抑制明显(P<0.01)。并分别用100nM,250nM及500nMBEZ235处理48h后,应用倒置显微镜观察给药前和给药后Panc-1细胞的形态,给药前饱满、紧密的Panc-1细胞给药后表现出分散、变形、排列紊乱及死亡,呈BEZ235浓度依赖性。3.BEZ235可抑制Panc-1细胞的迁移和浸润。划痕实验结果表明：与未给药的对照组相比,BEZ235药物处理24h、48h、72h后,Panc-1细胞的迁移能力明显受到抑制。Transwell实验结果证明：与未给药的对照组相比,250nMBEZ235药物处理48h后,Panc-1细胞的浸润能力明显受到抑制。Westernblotting结果证明：转移相关因子Ezrin和磷酸化Ezrin(p-Ezrin)的表达量呈浓度依赖性下降,而且其上游的SIX1蛋白表达水平也呈明显地浓度依赖性下降；此外,免疫荧光实验也证实：BEZ235可抑制Panc-1细胞中Ezrin及其上游SIX1蛋白的表达。4.BEZ235明显抑制Ezrin和SIX1基因表达。利用AffymetrixGeneChip微阵列分析得到的结果明确,在诸多转移相关因子中,BEZ235处理前后Ezrin和SIX1在Panc-1细胞中存在显著表达异常,且Ezrin和SIX1表达量呈浓度依赖性下降。5.SIX1蛋白过表达提示胰腺癌患者的不良预后。免疫组化结果显示：与正常胰腺组织相比,SIX1蛋白在胰腺癌组织中表达明显增强,且SIX1蛋白过表达与胰腺癌不良预后明显相关,即SIXl蛋白表达与肿瘤大小、临床分期及组织学分级有密切关系。单因素及多因素分析结果表明,SIX1蛋白过表达可以作为胰腺癌预后判定的独立预测因子。结论：BEZ235可有效抑制胰腺癌Panc-1细胞的迁移及浸润；SIX1在胰腺癌发生发展过程中起重要作用,其蛋白过表达提示胰腺癌患者的不良预后,并有望成为胰腺癌的独立风险预测指标。
【作者】金爱花；
【导师】朴熙绪；
【作者基本信息】延边大学，内科学，2014，博士
【关键词】胰腺癌；BEZ235；PI3K/Akt；SIX1；

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