雷公藤甲素通过Caspase-3介导的ROCK1活化和MLC磷酸化诱导人白血病细胞凋亡

【摘要】白血病是严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤，是儿童及35岁以下人群死亡率最高的恶性肿瘤，近年来白血病发病率和死亡率不断升高，针对白血病治疗药物的研究日益突显出其重要性和迫切性。天然植物中的活性成分是抗肿瘤药物的重要来源，雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是传统中药雷公藤的主要有效成分之一，具有抗感染、免疫抑制等作用，临床上常用于治疗关节炎、自身免疫性疾病。最近研究发现雷公藤甲素对于包括白血病在内的多种肿瘤细胞具有较强的抗肿瘤活性，但其抗白血病作用的具体分子机制尚不完全明确。ROCK1蛋白作为Rho亚家族下游最重要的效应分子之一，主要在调控细胞形态、极性、细胞骨架重构和细胞迁移等多个方面发挥生理功能。近年来研究发现ROCK1蛋白在肿瘤的发生发展中起着重要作用，参与调控肿瘤细胞的生存、凋亡以及恶性肿瘤的侵袭与转移。ROCK1分子活性受多种蛋白调控，例如RhoA和Caspase-3等，ROCK1分子常通过与活化状态的RhoA(与GTP耦联)结合或被Capsase-3裂解而激活。ROCK1蛋白作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能直接磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)，或磷酸化肌球蛋白磷酸酶结合亚基(MYPT)使其失活，从而直接或间接地增加MLC磷酸化水平，进而在细胞中发挥多种生物学功能。课题组前期实验发现雷公藤甲素能诱导人白血病细胞发生凋亡，但其作用的分子机制尚不清楚。本研究采用流式细胞术、Westernblotting、细胞免疫荧光、Si-RNA、TUNEL、免疫组织化学等方法，从白血病细胞株、患者原代白血病细胞、裸鼠移植瘤模型等方面研究雷公藤甲素抗白血病的效应及分子机制。研究发现雷公藤甲素能选择性诱导人白血病细胞凋亡，伴随线粒体膜电位丢失、细胞色素c释放、凋亡诱导因子(AIF)核聚集和Bax从胞浆转位至线粒体；Caspase-3介导的ROCK1活化和MLC磷酸化在雷公藤甲素诱导人白血病细胞凋亡中发挥重要作用；体内试验证实ROCK1活化和MLC磷酸化在雷公藤甲素抑制小鼠白血病细胞移植瘤模型的肿瘤生长中起着重要作用。总之，我们的研究发现了雷公藤甲素作用的新的分子靶点，对于抗白血病新药的研发和新的抗白血病靶点的发现具有重要意义。本研究的主要内容和结果如下：一、雷公藤甲素诱导人白血病细胞凋亡和线粒体损伤1、流式细胞术(AnnexinV/PI双染)检测雷公藤甲素诱导人白血病细胞株U937细胞凋亡的效应，发现随着药物作用浓度和时间的增加，细胞凋亡率增大，呈现一定的量效关系和时效关系；同时，还观察到雷公藤甲素能诱导其它白血病细胞株Jurkat细胞和HL-60细胞发生凋亡；收集44例临床白血病患者和6例健康供体骨髓或外周血样本，流式细胞术检测雷公藤甲素诱导患者原代白血病细胞凋亡的效应，发现药物能诱导原代白血病细胞发生明显凋亡，并呈现一定的时效关系，而对正常CD34+细胞影响很小。Westernblotting检测凋亡相关蛋白表达情况，发现与凋亡检测结果相似，随着雷公藤甲素作用浓度和时间的增加，U937细胞中PARP、Caspase-3和Caspase-9逐渐裂解激活；此外，在其它白血病细胞株Jurkat细胞和HL-60细胞中，也观察到凋亡相关蛋白相应地裂解激活；雷公藤甲素还能诱导原代白血病细胞中PARP、Caspase-3和Caspase-9裂解激活，而对正常CD34+细胞中凋亡相关蛋白表达无明显影响，提示雷公藤甲素可能具有高效、低毒抗白血病的效应。2、流式细胞术检测线粒体膜电势，发现随着雷公藤甲素作用浓度和时间的增加，U937细胞中线粒体膜电势丢失增多，呈现一定的量效和时效关系；Westernblotting检测发现雷公藤甲素诱导U937细胞中细胞色素c从线粒体释放至胞浆中，凋亡诱导因子(AIF)从线粒体向细胞核内聚集，同时，细胞免疫荧光分析观察到雷公藤甲素诱导AIF核聚集存在一定的时间依赖效应，此外，在其它白血病细胞株Jurkat细胞和HL-60细胞中，也观察到相应的细胞色素c释放和AIF核聚集；Westernblotting检测和细胞免疫荧光分析发现，雷公藤甲素诱导U937细胞中促凋亡因子Bax蛋白从胞浆转位至线粒体膜上，同时，在Jurkat细胞和HL-60细胞中也观察到Bax蛋白转位的现象，说明Bax蛋白转位在雷公藤甲素诱导白血病细胞凋亡中发挥重要作用。上述结果提示雷公藤甲素能选择性地诱导白血病细胞凋亡，并伴随线粒体膜电势丢失、细胞色素c释放、AIF核聚集和Bax从胞浆转位至线粒体。二、雷公藤甲素通过ROCK1/MLC信号通路诱导白血病细胞凋亡1、为研究雷公藤甲素诱导白血病细胞凋亡的分子机制，采用Westernblotting检测相关信号通路激活情况。在雷公藤甲素作用下，ROCK1分子裂解激活，进而磷酸化下游底物MLC和MYPT，并且雷公藤甲素诱导ROCK1/MLC(MYPT)信号通路激活存在一定的量效和时效关系。由于ROCK1常通过与活化态的RhoA(GTP-RhoA)结合而激活，因此我们采用pull-down方法分析雷公藤甲素是否影响RhoA活性，结果发现雷公藤甲素对RhoA活性(GTP-RhoA)和总RhoA水平并无明显影响。进一步采用RhoA抑制因子胞外酶C3预处理U937细胞和原代白血病细胞，发现抑制RhoA活性对雷公藤甲素诱导的白血病细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达、ROCK1裂解激活情况以及MLC和MYPT磷酸化水平均无明显影响。由于ROCK1还常被Caspase-3裂解激活，我们利用caspase抑制剂z-VAD-fmk或z-DEVD-fmk预处理U937细胞和原代白血病细胞，发现抑制caspase活性可显著降低雷公藤甲素诱导的白血病细胞凋亡、凋亡相关蛋白表达、ROCK1裂解激活以及MLC和MYPT磷酸化水平；上述结果说明雷公藤甲素诱导的ROCK1活化依赖于capsase-3活性，而不依赖于RhoA活性。2、为进一步验证ROCK1/MLC信号通路在雷公藤甲素诱导白血病细胞凋亡中的作用，我们利用抑制剂ML-7抑制MLC磷酸化水平，结果发现用ML-7预处理U937细胞和原代白血病细胞，能显著降低雷公藤甲素诱导的白血病细胞凋亡、凋亡相关蛋白裂解激活、细胞色素c释放和MLC磷酸化水平；同时，我们利用抑制剂Y-27632抑制ROCK1活性，结果发现用Y-27632预处理U937细胞和原代白血病细胞，能显著降低雷公藤甲素诱导的白血病细胞凋亡、凋亡相关蛋白裂解激活和细胞色素c释放，还能减少ROCK1裂解激活以及MLC和MYPT磷酸化水平；我们进一步采用si-RNA基因敲降的方法降低U937细胞中ROCK1蛋白的表达，发现抑制ROCK1表达，能显著降低雷公藤甲素诱导的白血病细胞凋亡，同时降低凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3和Caspase-9的裂解激活，还能降低MLC和MYPT磷酸化水平；上述结果说明ROCK1/MLC通路在雷公藤甲素诱导的白血病细胞凋亡中发挥至关重要的作用。三、雷公藤甲素裸鼠体内抑制白血病细胞移植瘤生长，ROCK1/MLC信号通路在雷公藤甲素体内抗白血病效应中发挥重要作用1、皮下接种U937细胞构建人白血病细胞裸鼠异种移植瘤模型，随机分为生理盐水对照组和雷公藤甲素治疗组，定期测量裸鼠体重和瘤体体积，观察裸鼠状态和不良反应。与对照组相比，雷公藤甲素治疗组中裸鼠肿瘤生长受到显著抑制，而体重无明显差异，未观察到明显毒副反应，提示雷公藤甲素在一定的剂量和疗程内具有高效、低毒的体内抗白血病效应。进一步对移植瘤组织进行HE染色，发现雷公藤甲素治疗组中移植瘤组织细胞出现坏死、炎性细胞渗透和细胞纤维化；TUNEL检测发现雷公藤甲素治疗组中肿瘤组织细胞发生明显凋亡；免疫组织化学观察到雷公藤甲素治疗组肿瘤组织细胞中凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3表达增加；上述结果说明雷公藤甲素在裸鼠体内具有诱导白血病细胞凋亡的效应。2、为验证ROCK1/MLC信号通路在雷公藤甲素体内抗白血病效应中的作用，我们采用Westernblotting检测移植瘤组织中ROCK1激活情况，与对照组相比，雷公藤甲素治疗组的移植瘤组织中ROCK1出现明显裂解激活；采用免疫组织化学染色观察移植瘤组织中phospho-MLC表达情况，在雷公藤甲素治疗组移植瘤组织中检测到明显的phospho-MLC表达，而对照组中未发现明显表达；上述结果说明雷公藤甲素能在荷瘤鼠体内激活ROCK1/MLC信号通路，提示该通路在雷公藤甲素体内抗白血病效应中发挥重要作用。综上所述，本文主要结论如下：雷公藤甲素能诱导多种白血病细胞株和患者原代白血病细胞凋亡，并能有效抑制白血病细胞裸鼠移植瘤模型肿瘤生长，具有较强的体内外抗白血病效应；ROCK1/MLC信号通路激活在雷公藤甲素抗白血病过程中发挥重要作用，雷公藤甲素诱导的ROCK1活化依赖于Capsase-3活性，而不依赖于RhoA活性，并且ROCK1和Capsase-3分子之间存在一个正向调节环；本研究探明了雷公藤甲素诱导白血病细胞凋亡的分子机制：通过激活ROCK1/MLC信号通路，导致Bax蛋白转位至线粒体，从而引起线粒体损伤(细胞色素c释放)，最终导致caspase裂解激活，细胞发生凋亡。本研究为今后将雷公藤甲素及其衍生物开发为高效、低毒的白血病治疗新药提供了实验依据，也为把ROCK1和MLC分子作为抗白血病的潜在干预靶点提供了新思路。
【作者】刘蕾；
【导师】高宁；
【作者基本信息】第三军医大学，药理学，2014，博士
【关键词】雷公藤甲素；白血病；细胞凋亡；Caspase-3；ROCK1；MLC；

【参考文献】
[1]钟运健.心率变异性（HRV）在运动性疲劳诊断中应用的实验研究[D].江西师范大学,体育教育训练学,2004,硕士.
[2]尚晨.无固定期限劳动合同问题研究[D].沈阳师范大学,民商法学,2013,硕士.
[3]李新.论控制股东滥权行为的法律规制[D].河北经贸大学,经济法学,2012,硕士.
[4]王少华.发动机磁流变液压悬置设计理论与性能仿真研究[D].吉林大学,车辆工程,2013,硕士.
[5]王琳.蓄电池极板分拣系统及其动态称重传感器的研究与开发[D].南京师范大学,电工理论与新技术,2012,硕士.
[6]杨红美.基于案例推理的学习迁移研究[D].扬州大学,教育技术学,2012,硕士.
[7]谢佳.《护理结局分类》中照顾者测评量表的跨文化修订及实证研究[D].山西医科大学,护理学,2013,硕士.
[8]郭威.朝阳市龙城区城镇居民最低生活保障问题及对策研究[D].大连理工大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[9]李亚昕.素质导向高等职业教育课程模式研究[D].西南大学,教育学原理,2013,硕士.
[10]贺峰.红土镍矿直接还原焙烧—磁选试验研究[D].西安建筑科技大学,钢铁冶金,2013,硕士.
[11]童敏.城市污染河道底泥疏浚与吹填的重金属环境行为及生态风险研究[D].华东师范大学,环境工程,2014,博士.
[12]李丽.回转体结构强度及断裂力学的有限元分析[D].沈阳理工大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[13]李鹏飞.轴类零件轧制成型数值仿真研究[D].河北工程大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[14]李石,张钰.商业信息网站的知识管理战略[J].经济论坛,2004,23:60-62.
[15]刘晓逸.沈阳城市空间结构发展模式及其引导策略研究[D].沈阳建筑大学,城市规划与设计,2012,硕士.
[16]周玲.网络征婚广告的顺应研究[D].湖南师范大学,英语语言文学,2014,硕士.
[17]林弥.基于RT量子器件的数字电路设计[D].浙江大学,电路与系统,2004,硕士.
[18]刘玉忠,赵军.一类非线性开关系统二次稳定性的充要条件[J].自动化学报,2002,04:596-600.
[19]闫艳.吉林省涉农重点专项资金财务审计问题研究[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[20]朱玲.基于句法特征的汉语韵律边界预测的研究[D].西北师范大学,电路与系统,2013,硕士.
[21]韦立权.杉木无性系生长与材性综合遗传改良研究[D].广西大学,生态学,2004,硕士.
[22]陈康.初中生数学学习困难心理诱因调查及个案干预研究[D].鲁东大学,应用心理学,2014,硕士.
[23]褚士兵.石墨烯材料上储氢的第一性原理研究[D].兰州大学,2014.
[24]樊建成.多功能锅炉管精整线的工程设计与实践[J].冶金自动化,2003,03:48-51.
[25]刘英.某轿车行人保护技术的研究与应用[D].吉林大学,车辆工程,2012,硕士.
[26]高魏,闵捷,张安录.农地城市流转与城市化、经济增长动态关系的计量经济分析——以湖北省1980年至2003年为例[J].资源科学,2010,03:564-572.
[27]宋晓宇,薛春燕,许景科.关联规则在先进技术与产品推荐系统中的应用[J].沈阳建筑大学学报(自然科学版),2005,05:146-149.
[28]梁景原.“哲学无定论”问题探析[D].西南交通大学,科学技术哲学,2014,硕士.
[29]曾煜情.泉州市第一医院发展战略研究[D].华侨大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[30]王宇宁.基于Carsim的公路弯道路段车辆行驶稳定性研究[D].吉林大学,交通运输工程,2014,硕士.
[31]吴晓明.FBC160落地铣镗加工中心关键技术研究[D].大连理工大学,机械工程（专业学位）,2012,硕士.
[32]张彩.论艾耶尔的情感表达主义[D].南京师范大学,伦理学,2012,硕士.
[33]曹倩.包装形态设计中的模件化研究[D].西安美术学院,设计艺术学,2014,硕士.
[34]汤迎旭.中国民营企业的制度创新[D].天津大学,高级工商管理,2013,硕士.
[35]吴恒.漫画拟声拟态词的汉译极限[D].西南交通大学,日语语言文学,2014,硕士.
[36]李玉龙.中国女排与伦敦奥运会主要对手主动得分数据对比研究[D].鲁东大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[37]严伟光.西方生态学马克思主义研究[D].中南民族大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[38]王楚.模块化多电平变流器相间环流抑制的研究[D].华东交通大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[39]李文茂.肺癌特异性DKK1基因转录调控元件的分析预测及活性筛选[D].华侨大学,生物学,2014,硕士.
[40]马在田.地震反射图象探讨(续)[J].石油地球物理勘探,1975,04:24-31.
[41]张倩.鲫鱼IgM单链抗体的制备及嗜水气单胞菌抗体间接ELISA检测方法的建立[D].南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士.
[42]金岩.失地农民养老保障问题研究[D].山东财经大学,社会保障学,2012,硕士.
[43]王成金.企业内部市场链管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[44]季铮.近景目标三维重建的自动化方法研究[D].武汉大学,2007.
[45]韩琳.艺术人生的美学追求[D].西北大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[46]黄春红.植物饲料磷的利用及其影响因素研究[D].湖南农业大学,动物营养与饲料科学,2004,硕士.
[47]王丛.循环经济法中的金融支持条款研究[D].浙江大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[48]陈丽萍.论知识工作者管理[D].苏州大学,马克思主义哲学,2003,硕士.
[49]刘清.论刑事诉讼中被追诉人的财产权保护[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[50]李鑫,陆海东.危险化学品查询系统的设计与实现[J].吉林化工学院学报,2005,04:51-53.