神经细胞来源Microparticles在颅脑创伤相关凝血功能障碍发生中的机制研究

【摘要】目的：目前国际上尚缺乏颅脑创伤(traumaticbraininjury,TBI)相关凝血功能障碍明确的发生机制及有效的治疗方法。本实验将通过建立中型TBI小鼠模型,观察循环血中神经细胞来源microparticles(brain-derivedmicroparticles,BDMP)含量及凝血功能变化,结合体外制备BDMP的方法,体外研究BDMP的促凝作用,与血小板的相互作用及Lactadherin蛋白对BDMP的清除作用。试图阐明TBI相关凝血功能障碍的物质基础,明确TBI相关凝血功能障碍的发生机制,探讨建立预防治疗TBI引起的凝血功能障碍的新方法,成为研究TBI相关凝血功能障碍机制的新方向。方法：1)建立中型TBI小鼠模型,应用流式细胞仪和活化因子X凝血时间实验,检测TBI小鼠循环血中BDMP含量及凝血功能的变化；2)应用脑组织匀浆分步离心的方法体外制备BDMP;3)应用透射电镜、流式细胞仪和WesternBlot方法鉴定所得BDMP的形态学及表型；4)应用活化因子X凝血时间实验和凝血酶生成实验,体外检测BDMP的促凝作用；5)经鼠尾静脉注射BDMP到正常小鼠体内,应用活化因子X凝血时间实验、血浆纤维蛋白原水平测定和病理PTAH染色方法,体内检测BDMP的促凝作用；6)应用流式细胞仪和扫描电镜观察BDMP与血小板的结合情况；7)应用流式细胞仪检测BDMP对血小板的活化作用。8)应用Transwell小室系统检测BDMP在血小板介导下穿透HUVEC细胞的能力；9)应用流式细胞仪和活化因子X凝血时间实验检测Lactadherin蛋白对BDMP的清除作用。结果：1)TBI小鼠循环血中BDMP呈现先增高后降低的趋势,在TBI后3h时其表达达到顶峰。小鼠TBI后3h的贫血小板血浆(plateletpoorplasma,PPP)其凝血时间明显缩短,此时PPP中BDMP的表达最高。而在经过超速离心将BDMP去除后,无MP血浆(MP-freeplasma,MPFP)的凝血时间明显延长；2)透射电镜下BDMP具有完整的膜结构,且表面表达大量的胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)。流式细胞及WesternBlot结果显示BDMP表达大量的神经元和胶质细胞特异性标记,而不表达血小板、红细胞、白细胞和内皮细胞的标志物。BDMP上磷脂酰丝氨酸(PS)和组织因子在体外具有促凝作用。最后将BDMP注射到正常小鼠体内,小鼠PPP的凝血时间明显延长,血浆纤维蛋白原明显降低,组织中纤维素沉积明显；3)流式细胞仪和扫描电镜观察至BDMP能够与血小板结合,其结合后可以促进血小板表面PS的表达增加,同时可以激活血小板,导致血小板活化标志P-选择素表达增加和钙离子内流增加。反过来,激活的血小板可以介导BDMP穿透激活的HUVEC细胞；4)Lactadherin蛋白可以和BDMP结合,并在结合后减弱BDMP的促凝作用。结论：1)TBI小鼠循环血中检测到具有促凝活性的BDMP,可能是发生TBI相关凝血功能障碍的物质基础；2)通过脑组织匀浆分步离心的方法在体外成功制备出了大量的、纯度高的BDMP,为后续的体外实验提供了充足的原料；3)BDMP能够激活血小板,而激活的血小板可以协助BDMP穿透BBB,部分解释了TBI相关凝血功能障碍的发生机制；4)BDMP可与Lactadherin蛋白结合,能够抑制BDMP的促凝活性,该BDMP的清除机制,为TBI合并凝血功能障碍的治疗提供了一条新思路。
【作者】田野；
【导师】张建宁；
【作者基本信息】天津医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】颅脑外伤；凝血功能障碍；磷脂；组织因子；微粒；

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