ILT2在结核患者NK细胞的表达及作用研究

【摘要】结核病是引起死亡人数高居第二位的感染性疾病。由于耐药结核的产生、艾滋病感染流行、人口流动和临床免疫抑制剂的应用增多等原因，全球结核病疫情非常严重，仅2012年，全球新发结核病例达860万，有130万人死于结核病，约45万人为耐多药结核病。我国现有活动性肺结核病人约500万，每年约有13万人死于结核病。尽管结核感染人数众多，但是仅有5-10%的感染者发展成为活动性结核。研究结果表明，结核病的发生、发展和转归不仅仅取决于结核分枝杆菌的数量和毒力,在很大程度上还取决于机体的免疫状态。宿主固有免疫在结核病早期发挥抗结核分枝杆菌感染作用，而且对于激发宿主获得性免疫也发挥了重要作用。在结核分枝杆菌入侵早期，获得性免疫未被充分激活之前，固有免疫系统在结核分枝杆菌的控制和清除过程中发挥着重要作用。参与固有免疫细胞主要为NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性白细胞等，它们无须抗原预先致敏,主要通过释放细胞因子、穿孔素、颗粒酶、表达配体等发挥作用，诱导免疫细胞聚集，杀伤靶细胞。NK细胞是参与抗结核固有免疫的重要细胞，具有细胞毒性效应，能分泌IFN-γ等细胞因子，同时具有免疫调节的功能。为了保持抗感染免疫的平衡，NK细胞的功能由位于细胞表面不同的激活和抑制型受体共同进行调节。免疫球蛋白样转录子2（ILT2，又称CD85j，LILRB1，LIR-1）是一种I型转膜蛋白，胞浆区含有四个免疫受体酪氨酸抑制性基序。该受体通过动员如SHP-1的Src同源结构域（SH2）蛋白参与ITIM酪氨酸磷酸化的负信号调节。ILT2在NK细胞、T细胞、B细胞、单核细胞和树突细胞上均有表达，与MHC-I类分子（HLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-E和HLA-G）结合，同时，ILT-2还能识别其他蛋白，如人类巨细胞病毒（HCMV）编码的UL18蛋白。目前，ILT2在抗结核感染免疫中的作用尚不明确。为此，本论文开展了对ILT2在结核患者NK细胞的表达及作用的研究：第一，研究NK细胞及亚群在肺结核患者外周血淋巴细胞的分布情况，研究ILT2在肺结核患者NK细胞上的表达及与结核病情严重程度的关系。研究对象包含肺结核组（n=70）和健康对照组（n=67），根据痰涂片或痰培养结果将肺结核组分为菌阳组（n=41）和菌阴组肺结核组（n=29）。首先采集活动性肺结核组和健康对照组的新鲜外周EDTA抗凝血,密度梯度离心分离PBMCs，用荧光标记的抗人CD3、CD56、CD16进行染色，流式细胞术检测CD3-CD56+NK细胞及两个亚型CD3-CD56dimCD16+和CD3-CD56brightCD16+/-的分布比例。研究结果显示，活动性肺结核患者外周血淋巴细胞群中CD3-CD56+NK细胞的比例为2.3%(1.2%-4.0%)，明显低于健康对照组（7.8%；6.5%-11.9%)，p<0.0001；活动性肺结核外周血淋巴细胞群中CD3-CD56dimNK细胞的比例(3.6%；2.2-6.7%)明显低于健康对照组（9.2%；6.2-14.1%；p<0.0001），活动性肺结核组外周血淋巴细胞群中CD3-CD56brightNK细胞的比例(0.3%；0.2-0.6%)较健康对照组（0.5%；0.3-0.6%）显著下降（p=0.0002）。研究结果表明活动性肺结核患者外周血NK细胞及亚群的比例均明显下降。其次，采集肺结核组和健康对照组的新鲜外周EDTA抗凝血,密度梯度离心分离PBMCs，用荧光标记的抗人CD3、CD56、CD16和ILT2染色，流式细胞术检测ILT2抗体在NK细胞不同亚群上的表达。实验结果显示，活动性肺结核患者ILT2+CD56dimCD16+NK细胞比例45.7%(33.9%-56.2%)明显高于健康对照者19.1%(9.9-30.0%)，(p<0.0001)。ILT2在活动性肺结核组CD56brightCD16+/-NK细胞上的表达比例为2.6%（1.4-4.9%)，与健康对照组CD56brightCD16+/-NK细胞表达的比例2.4%（0.7-5.7%)相似，结果无统计学意义(p=0.5163)。研究结果表明活动性肺结核患者外周血ILT2+CD56dimCD16+NK细胞表达比例明显高于健康对照者。此外，比较了ILT2在菌阳活动性肺结核组和菌阴活动性肺结核组D56dimCD16+-NK细胞上的表达，分析ILT2在肺结核患者NK细胞上的表达与结核病病情的关系。实验结果显示，ILT2在菌阳肺结核组CD56dimCD16+NK细胞上的表达比例(55.3%；45.4-59.9%)明显高于菌阴肺结核组(32.9%；23.3-42.0%)，p<0.0001。实验结果表明ILT2在CD56dimCD16+NK细胞上的表达水平与肺结核病的病情严重程度相关。第二，通过研究ILT2表达与NK细胞CD107a表达的关系及ILT2表达与NK细胞分泌IFN-γ的关系，探究ILT2对肺结核患者NK细胞的细胞毒作用和干扰素分泌的影响。同时通过检测ILT2+CD56dimNK细胞的自然凋亡与ILT2-CD56dimNK细胞的自然凋亡以研究ILT2对NK细胞的自然凋亡作用。研究对象为38例活动性结核患者，痰涂片或痰培养结果阳性。首先，以K562细胞为靶细胞，以5:1比例将15例活动性结核患者外周血单个核细胞与靶细胞K562共孵育，加入抗人CD107a荧光抗体。采用流式细胞术分析CD107a在ILT2+CD56dimNK和ILT2-CD56dimNK细胞上的表达区别。实验结果显示，CD107a在ILT2+CD56dimCD16+NK细胞的表达比例显著低于ILT2-CD56dimNK细胞(p=0.0169)。结果表明ILT2在CD56dimNK细胞的表达与NK细胞细胞毒作用缺陷相关。其次，采用胞内染色方法，将10例活动性肺结核患者单个核细胞与靶细胞K562混合孵育，加入monensin，细胞表面荧光染色后，行细胞破膜，加入FITC-标记抗人IFN-γ单抗，流式细胞术检测IFN-γ在ILT2+CD56dimNK细胞和ILT2-CD56dimNK细胞内的表达。实验结果显示，IFN-在ILT2+CD56dimNK细胞的表达明显少于ILT2-CD56dimNK细胞（p=0.0038）。结果表明ILT2在CD56dimNK细胞的表达与NK细胞IFN-γ分泌水平降低相关。此外，加入抗ILT2的阻断抗体及同型对照抗体，将CD56dimCD16+NK细胞与靶细胞K562进行孵育，流式细胞术检测阻断ILT2信号通路后CD107a在CD56dimCD16+NK细胞上表达情况。实验结果显示，阻断ILT2信号通路后，CD107a在CD56dimCD16+NK细胞上表达的比例较加入同型对照后明显升高（p=0.0223）。结果表明阻断ILT2信号通路可提高CD56dimCD16+NK细胞的细胞毒作用。最后，采用AnnexinV与PI双染方法判定NK细胞自然凋亡，采用流式细胞术检测，比较分析ILT2+CD56dimNK细胞和ILT2-CD56dimNK细胞的凋亡比率。实验结果显示，ILT2+CD56dimNK细胞的自然凋亡率显著高于ILT2-CD56dimNK细胞(p=0.0335)。研究结果表明ILT2可促进活动性肺结核患者CD56dimCD16+NK细胞的自然凋亡。本研究采用流式细胞术,开展了对ILT2在结核患者NK细胞的表达及作用的研究。研究发现，活动性肺结核患者外周血中NK细胞及亚群的分布比例均显著下降；ILT2在活动性肺结核患者CD56dimCD16+NK细胞上的表达频率升高，并与活动性结核病的病情严重程度相关；ILT2对活动性结核患者CD56dimNK细胞的细胞毒作用和细胞因子分泌的功能具有抑制作用；ILT2可促进活动性肺结核患者CD3-CD56dimNK细胞的自然凋亡。本研究为更深入了解NK细胞抗结核感染免疫理论，建立基于增强NK细胞功能的抗结核免疫治疗提供了新的思路。
【作者】孟祥红；
【导师】程小星；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病原生物学，2014，博士
【关键词】结核病；免疫；ILT2；NK细胞；

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