PAQR3过表达对氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其可能机制

【摘要】第一章氧糖剥夺再灌注后高尔基体蛋白PAQR3的表达变化目的：探讨氧糖剥夺再灌注后细胞形态、细胞活性、细胞凋亡以及高尔基体蛋白PAQR3的表达变化。方法：以小鼠来源神经瘤母细胞N2a细胞为研究对象,经历氧糖剥夺再灌注后,采用倒置光学显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,流式双染法检测细胞凋亡,并应用Real-timePCR和Westernblot技术分别检测PAQR3的mRNA和蛋白表达。结果：1.细胞形态的变化：氧糖剥夺4小时再灌注12小时及24小时后,细胞形态明显受损,贴壁能力减弱,细胞之间的间隙增大,折光性降低,胞体轮廓模糊,突起减少或消失,细胞缩小变圆,部分死亡崩解的细胞抱团悬浮于培养液中。2.细胞活性的变化：与正常组比较,氧糖剥夺4小时再灌注0小时和4小时细胞活性出现下降,但差异不具有统计学意义(P>0.05)；而再灌注12小时和24小时,与正常组比较,细胞活性明显下降(P<0.05)。3.细胞凋亡率的变化：氧糖剥夺4小时再灌注4小时、12小时和24小时,细胞的凋亡率明显增高,与正常组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.PAQR3mRNA的表达变化：与正常组相比,氧糖剥夺4小时再灌注0小时与4小时PAQR3mRNA的表达明显减少(P<0.05)；再灌注12小时和24小时,PAQR3的mRNA表达进一步减少,与正常组比较,具有显著性统计学差异(P<0.01)。5.PAQR3的蛋白表达变化：与正常组相比,氧糖剥夺4小时再灌注0小时,PAQR3的蛋白表达稍有减少,但差异不具有统计学意义(P>0.05)；而再灌注4小时、12小时和24小时,PAQR3的蛋白表达明显减少(P<0.05)。结论：1.氧糖剥夺再灌注导致细胞形态受损、活性下降,诱导细胞凋亡。2.氧糖剥夺再灌注下调高尔基体蛋白PAQR3的表达。第二章小鼠PAQR3真核表达载体的构建及表达目的：构建小鼠PAQR3真核表达质粒并验证其在N2a细胞中的表达。方法：从Genebank找到小鼠PAQR3基因全长序列,通过人工化学合成,装载于表达载体CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin,大量扩增后进行PCR鉴定和测序证实其正确性。将鉴定正确的重组质粒利用脂质体法转染N2a细胞,并采用荧光显微镜观察转染效率、MTT法评估PAQR3过表达对N2a细胞生长曲线的影响、Real-timePCR和Westernblot技术分别检测转染后细胞中PAQR3的基因和蛋白表达水平。结果：成功构建了小鼠PAQR3真核表达质粒,并利用脂质体法成功转染N2a细胞,经荧光显微镜检测,转染后72小时转染效率最高；MTT法检测显示,与正常细胞和空载体转染细胞相比,PAQR3过表达对N2a细胞的生长曲线无明显影响；Real-timePCR和Westernblot技术检测显示转染细胞株中PAQR3的基因和蛋白明显高表达。结论：成功构建小鼠PAQR3真核表达质粒并在N2a细胞中高表达。第三章PAQR3过表达对氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其可能机制目的：研究PAQR3过表达在氧糖剥夺再灌注损伤中的作用并探讨其可能机制。方法：将构建成功的PAQR3真核表达质粒转染N2a细胞,经历氧糖剥夺再灌注后,采用倒置光学显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞活性,流式双染法检测细胞凋亡率的变化；选取细胞形态、活性、凋亡率变化最显著的时间点,应用Real-timePCR检测ERK1、ERK2和AKT的mRNA表达；Westernblot技术检测PAQR3、ERK1/2、AKT、GSK3β和对应的磷酸化蛋白p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、p-AKT(Ser473)、p-GSK3β(Ser9)蛋白的表达。结果：1.PAQR3真核质粒转染的细胞,经氧糖剥夺4小时再灌注12及24小时后,与空载体组相比,细胞形态受损明显减轻,细胞活性增高(P<0.05),凋亡率下降(P<0.01)。2.PAQR3真核质粒转染的细胞,经氧糖剥夺4小时再灌注12及24小时后,与空载体组相比,ERK1、ERK2和AKT的mRNA表达无显著差异(P>0.05)。3.正常细胞经氧糖剥夺4小时再灌注24小时后,与未OGD组相比,p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表达明显增多(P<0.05);PAQR3真核质粒转染的细胞,经氧糖剥夺4小时再灌注24小时后,与空载体组相比,PAQR3稳定高表达,p-ERK1/2(Thr202/Tyr204)的表达显著减少(P<0.05)。4.正常细胞经氧糖剥夺4小时再灌注24小时后,与未OGD组相比,p-AKT(Ser473)的表达显著增多(P<0.05),p-GSK3β(Ser9)的表达显著减少(P<0.05)；PAQR3真核质粒转染的细胞,经氧糖剥夺4小时再灌注24小时后,与空载体组相比,p-AKT(Ser473)和p-GSK3β(Ser9)的表达明显增多(P<0.05)。结论：1.PAQR3过表达可以减少氧糖剥夺再灌注对细胞的损伤。2.PAQR3过表达对氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用可能与抑制ERK通路和激活AKT/GSK3β通路有关。
【作者】彭文娜；
【导师】胡治平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】PAQR3；氧糖剥夺再灌注；神经保护作用；过表达；高尔基体；ERK；AKT/GSK3β；

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