SFRP2基因甲基化促进口腔粘膜鳞癌发生的分子机制研究

SFRP2基因甲基化促进口腔粘膜鳞癌发生的分子机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-16 分类:论文格式 喜欢:3001
师大云端图书馆

【摘要】口腔粘膜鳞状细胞癌(Oralsquamouscellcarcinoma,OSCC)是严重威胁人类健康的癌症之一。尽管近年来在治疗方法上取得了较大的进展,但其五年生存率仍然徘徊在55%~60%。研究发现吸烟是诱发OSCC的重要危险因素之一,而且长时间接触烟草的OSCC患者,治疗后复发率和第二原发癌发生的危险性也明显升高。此外,有学者研究证实烟草中致癌物质可能与OSCC患者DNA甲基化水平有关。众所周知,作为一种重要的肿瘤表观遗传学机制,DNA甲基化水平或模式发生变化,包括基因组整体甲基化水平降低所导致的原癌基因激活、突变热点形成、转座子异常表达以及基因组不稳定性等,都会对肿瘤的发生有促进作用。Wnt信号通路与多种人类肿瘤的发生、发展和形成具有密切的关系。分泌型卷曲相关蛋白家族(secretedfrizzled-relatedproteins,SFRPs)是一种分泌型糖蛋白,能够通过竞争结合Wnt蛋白受体或直接与Wnt蛋白结合,影响该信号通路的生物学功能。SFRP2基因是SFRPs家族成员之一,该基因定位于染色体4q31.3,具有3个外显子和2个内含子,第1外显子附近有密度较高的CpG岛。研究认为,SFRP2基因启动子区CpG岛的甲基化,能够下调SFRP2的表达,从而导致对Wnt通路的抑制作用减弱,引起细胞的过度增殖,诱发肿瘤的发生和发展。多项研究表明,SFRP2基因甲基化水平与结肠癌、食管癌、胃癌等多种肿瘤的发生、发展及预后有关。本课题旨在通过以下四个部分的研究,从体外和体内两个层次系统探讨SFRP2基因甲基化水平在OSCC发生发展中的作用及其分子机制。类似研究国内外尚未见报道。第一部分:口腔鳞癌组织中SFRP2基因甲基化的发生及其临床意义目的:探讨Wnt通路拮抗基因家族分泌型卷曲相关蛋白——SFRP2基因在口腔鳞癌组织中的甲基化状态及其临床意义。方法:收集2010年10月至2011年8月于苏州大学某医院口腔科手术治疗、经病理确诊为OSCC的肿瘤组织49例以及与其相配对的癌旁正常组织49例。采用甲基化特异PCR法(methylation-specificPCR,MSP)及亚硫酸氢盐处理后测序法(bisulfitesequencingPCR,BSP)检测口腔鳞癌及癌旁正常组织中SFRP2基因的甲基化状态,分析SFRP2基因甲基化与相应临床病理特征之间的关系。采用RT-PCR法检测SFRP2mRNA表达情况,并分析其与SFRP2基因甲基化之间的关系。结果:MSP检测结果显示,口腔鳞癌组织中SFRP2基因甲基化的发生率为75.51%(37/49),明显高于癌旁正常组织(6.12%;3/49)。通过对BSP产物进行克隆和多次核酸序列测定,进一步证实癌组织中SFRP2基因启动子在CpG岛的甲基化程度明显高于癌旁组织(P<0.01)。此外,SFRP2基因甲基化与临床分期相关,重度吸烟患者的肿瘤组织中SFRP2基因甲基化的发生率较高。RT-PCR结果表明,口腔鳞癌组织中SFRP2mRNA表达缺失率为85.71%(42/49),而相应的癌旁组织均有SFRP2mNRA表达。37例发生SFRP2基因启动子甲基化的口腔鳞癌组织中mRNA表达缺失率为94.59%(35/37),未发生SFRP2基因启动子甲基化的癌组织中表达缺失率为41.67%(5/12),差异具有显著性(P<0.05)。结论:口腔鳞癌组织中SFRP2基因启动子区呈现高甲基化状态,而且其mRNA表达水平明显下调。提示该基因的甲基化可能是其基因失活的主要机制之一,而且吸烟与SFRP2基因的甲基化可能有一定相关性。第二部分:5-Aza-dC对口腔鳞癌细胞Tca8113增殖、凋亡及SFRP2基因甲基化的影响目的:观察5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-dC)对体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113中SFRP2基因的甲基化状态和mRNA表达的作用,并研究5-Aza-dC对人舌鳞癌细胞Tca8113的增殖、细胞周期及细胞凋亡的影响。方法:用不同浓度的5-Aza-dC处理体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113。24h后,采用MSP法检测、比较5-Aza-dC处理前后SFRP2基因的甲基化状态;采用RT-PCR法和Westernblot法检测细胞中SFRP2mRNA及蛋白表达的变化情况;采用MTT法和克隆形成实验检测细胞的增殖活性;采用流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡的变化。结果:体外培养的人舌鳞癌细胞系Tca8113中SFRP2基因启动子区域高度甲基化,而且SFRP2mRNA和SFP2蛋白的表达均处于较低水平。经5-Aza-dC处理之后,SFRP2基因甲基化状态得到明显逆转,SFRP2mRNA和蛋白的表达水平也逐渐增加,并呈现出5-Aza-dC药物浓度依赖性。MTT法和克隆形成实验发现,不同浓度的5-Aza-dC处理后,Tca8113细胞生存率逐渐下降,细胞生长抑制率逐渐上升,细胞生长变慢。流式细胞仪检测结果表明,不同药物浓度处理24h后Tca8113细胞周期与对照组相比发生明显的G1期阻滞与细胞凋亡,并同样呈现药物浓度依赖关系。结论:在人舌鳞癌细胞系Tca8113中,同样呈现SFRP2基因启动子区高度甲基化和其mRNA和蛋白表达水平的下调。5-Aza-dC能够逆转Tca8113细胞中SFRP2基因的甲基化状态,并能恢复其mRNA和蛋白的表达。同时,5-Aza-dC可抑制Tca8113细胞增殖,改变细胞周期分布,促进细胞凋亡,其机制可能与该药物对SFRP2基因的去甲基化作用有关。第三部分:SFRP2基因在口腔鳞癌细胞Tca8113中的生物学功能及其机制的研究目的:研究SFRP2基因在Tca8113中的生物学功能及可能的分子机制,为进一步研究该基因在OSCC发生发展中的作用提供更多的实验依据。方法:构建能够表达SFRP2的重组质粒pcDNA3.\+/SFRP2,并设计、合成SFRP2小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),通过脂质体介导转染Tca8113细胞。采用RT-PCR和WesternBlot法分别检测细胞中SFRP2的mRNA和蛋白的表达情况,建立高表达SFRP2的细胞模型Tca8113/SFRP2口SFRP2基因敲减的体外细胞模型。采用WesternBlot检测Wnnt信号通路中相关蛋白分子的表达情况。采用MTT法和克隆形成实验研究该基因对细胞增殖的影响,并采用流式细胞仪分析SFRP2的表达水平与细胞周期分布之间关系。结果:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1+/SFRP2,经测序鉴定后转染Tca8113细胞,通过G418筛选,获得稳定高表达SFRP2的人舌鳞癌细胞Tca8113/SFRP2。同时,通过对siRNA的筛选,成功获得能够有效抑制Tca8113细胞中SFRP2表达的siRNA.Westernblot检测结果显示SFRP2高表达能够引起Wnt信号通路中磷酸化GSK-3p和β-catenin的表达增加,并降低通路下游关键效应因子CyclinD1的表达水平;而采用siRNA敲减Tca8113细胞中SFRP2基因,则能够导致磷酸化GSK-3β和β-catenin表达水平的下降,但对CyclinD1的表达无显著影响。此外,SFRP2过表达可显著抑制Tca8113细胞的增殖,引起细胞周期G1期阻滞;而敲减SFRP2表达,则能够促进Tca8113细胞的增殖,并引起细胞周期S期比率增加。结论:SFRP2能够调控Tca8113细胞的增殖周期,抑制Tca8113细胞的体外增殖,其机制可能部分与影响Wnt信号通路中信号蛋白分子GSK-3β,β-catenin的磷酸化和CyclinD1的表达有关。第四部分:口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型中SFRP2基因功能研究目的:研究在裸鼠中,SFRP2基因对人口腔鳞癌移植瘤形成的抑制作用及相关分子机制。方法:体外培养稳定高表达SFRP2的Tca8113/SFRP2细胞株和空质粒转染的细胞株Tca8113/pc3.1,并分别将指数生长期的上述细胞接种于20只裸鼠右前肢皮下(每种细胞株接种10只),建立裸鼠移植瘤模型。成瘤后每3d测量瘤体长径a和短径b,按照公式V=ab2π/6计算瘤体积,绘制肿瘤增殖曲线。第28d安乐死处死动物,完整解剖出瘤块,常规进行固定、石蜡包埋与切片,经HE染色观察其组织病理学特征,并采用免疫组织化学法检测各组标本中Ki67、β-catenin、CyclinD1的表达情况。结果:成功建立Tca8113/SFP2和Tca8113/pc3.1裸鼠移植瘤模型,形成的体内肿瘤具有典型的口腔鳞癌组织病理学特征。结果表明,SFRP2高表达虽然不能抑制裸鼠体内OSCC的体内成瘤,但与空质粒对照组相比,能显著抑制移植瘤的增殖(P<0.05)。免疫组化结果显示,与Tca8113/pc3.1组相比,Tca8113/SFRP2组小鼠体内Ki67和CyclinDl表达水平明显降低,而胞浆与胞膜β-catenin的表达水平明显增高。结论:本部分研究首次证实,SFRP2能够通过调控细胞周期并部分的影响Wnt信号通路,抑制OSCC在裸鼠体内的形成和发展。
【作者】肖灿;
【导师】周建华;张陈平;
【作者基本信息】苏州大学,公共卫生学,2013,博士
【关键词】口腔鳞状细胞癌;甲基化;分泌型卷曲相关蛋白2;Wnt信号通路;5-Aza-dC;

【参考文献】
[1]胡健.企业信息化管理中如何运用计算机技术探讨[J].电子技术与软件工程,2015,05:189.
[2]吕笑.行政机关自行强制执行问题研究[D].中国政法大学,法律,2004,硕士.
[3]王星宇.基于靶序列环化的新型滚环扩增方法的建立及其应用[D].中国海洋大学,食品科学,2014,博士.
[4]齐晓明.英首次将石墨烯变成绝缘体[J].成才之路,2011,31:93.
[5]柴双超.非营利组织档案管理模式研究[D].黑龙江大学,档案学,2013,硕士.
[6]崔昭海.浅析放松训练对散打运动技能的影响[D].辽宁师范大学,体育教育训练学,2012,硕士.
[7]朱瑛,程明,花为,王伟.新型双功率流风力发电系统控制策略[J].电力系统自动化,2013,10:48-53+71.
[8]胡鹏超.偏冷环境下局部热刺激对人体热舒适的影响研究[D].重庆大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2014,硕士.
[9]何薇.NADPH氧化酶4在心肌缺氧/复氧损伤中的作用及机制研究:线粒体NAD~+/NADH-Sirt3信号机制[D].第四军医大学,内科学(专业学位),2014,硕士.
[10]马龙.当前高中体育特长生思想行为现状及对策[D].华中师范大学,学科教学,2014,硕士.
[11]杜玉敏.硕士研究生教育质量评估中的学生评价研究[D].山西财经大学,教育经济与管理,2014,硕士.
[12]王红艳.绿豆芽离心损伤生理及抗病性研究[D].浙江工商大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[13]陆欣.逆向工程中数据测量噪声与三角网格滤波技术研究[D].南京航空航天大学,航空宇航制造工程,2004,硕士.
[14]王长荣.pCD86-RAE-1ε转基因小鼠的深入鉴定及细胞免疫功能分析[D].扬州大学,病理学与病理生理学,2011,硕士.
[15]徐春丽.基于动态概率关系模型的规划识别研究及应用[D].江苏科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[16]李国斌.铁路建设中信号设计方案的选择及系统集成的考虑[J].铁道通信信号.2007(03)
[17]陆铭.南方大型企业生活区空间环境设计研究[D].湖南大学,建筑设计及其理论,2011,硕士.
[18]芮灵芝.信息技术与高中学生英语自学能力培养的有效整合模式探究[D].东北师范大学,现代教育技术,2012,硕士.
[19]赵江敏刘海娇.京津翼一体化区域创新系统的构建研究[J].经营管理者,2015,01:.
[20]瞿寿德,李松石,戴和平.应用Galerkin方法辨识一维抛物型偏微分方程及其边界条件中的参数[J].自动化学报,1989,02:156-160.
[21]周一川.一种基于VCCS补偿的高性能LDO设计[D].湖北大学,微电子学与固体电子学,2012,硕士.
[22]李光飞.基于液动力修正的锥阀振动特性研究[D].西南交通大学,机械电子工程,2013,硕士.
[23]高霞.FeCP配位聚合物在活体分析化学中的应用研究[D].华南理工大学,2014.
[24]陈实.虚拟试验系统中AUV目标探测信息处理方法的研究[D].国防科学技术大学,仪器科学与技术,2012,硕士.
[25]吴耀.电压不对称条件下并网逆变器控制策略研究[D].江苏科技大学,电力电子与电力传动,2014,硕士.
[26]李凡.单目图像中带有表情的人脸曲面恢复关键技术研究[D].华中科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[27]于梦怡.《新周刊》杂志广告研究[D].黑龙江大学,传播学,2013,硕士.
[28]鲁其辉.基于成本共担策略的服务供应链协调研究[J].控制与决策,2011,11:1649-1653.
[29]王静.新课改后高中生数学能力因素的调查研究[D].华中师范大学,学科教学,2013,硕士.
[30]艾龙飞.楚文化与荆楚武术发展战略研究[D].华中师范大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[31]张波.从写实到表现—浅谈对中国油画风景的再认识[D].吉林大学,美术学,2014,硕士.
[32]李微.基于微波干燥的红枣水分快速检测系统的研究[D].吉林农业大学,农业电气化与自动化,2012,硕士.
[33]黄海.基于NAND Flash芯片的高速大容量固态存储技术[D].西安电子科技大学,电路与系统,2010,硕士.
[34]吴涛.新疆高风险遗传性乳腺癌BRCA1/2基因突变、启动子甲基化检测及相关因素分析研究[D].新疆医科大学,外科学(专业学位),2013,博士.
[35]张丽华.关联理论对广告及其翻译的诠释力[D].福建师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[36]赵莹.《大英百科年鉴1995·环境》翻译实践报告[D].郑州大学,翻译(专业学位),2013,硕士.
[37]徐家壮,唐虎,李忠明.低维度碳纳米填料诱导聚合物结晶[J].高分子通报,2011,01:16-23.
[38]班辉.原位合成法制备磷钨酸掺杂的聚乙烯醇/聚偏氟乙烯质子交换膜及其应用[D].内蒙古科技大学,冶金工程,2014,硕士.
[39]杜晓彦.秸秆饲料成型工艺及成型后液体添加剂真空后喷涂研究[D].河南科技大学,食品科学,2013,硕士.
[40]刘福佳.网壳结构设计及其减震控制研究[D].大连理工大学,建筑与土木工程(专业学位),2013,硕士.
[41]董艳萍.基于VMI的QSMC公司库存管理策略研究[D].辽宁工程技术大学,企业管理,2012,硕士.
[42]黄曼,郭云龙,武斌,刘云圻,付朝阳,王帅.化学气相沉积法合成石墨烯的转移技术研究进展[J].化学通报,2012,11:974.
[43]梁志刚.基于AT91SAM9261的嵌入式Linux的移植及其应用研究[D].浙江工业大学,2009.
[44]孟子健.区间不确定性传播的快速算法[D].长安大学,应用数学,2014,硕士.
[45]沈永康.空地超短波数据传输系统的设计与实现[D].北京化工大学,计算机技术(专业学位),2013,硕士.
[46]梁亮.美国汉学家夏含夷的《周易》研究[D].华东师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[47]丁伟,于世焕,徐淑合,曹国滨,李录明,赵殿栋.转换波技术在泥岩裂缝研究中的应用[J].石油地球物理勘探,2002,06:626-634+660.
[48]何剑萍,朱健伟,朱可建,程浩.结节性皮肤狼疮黏蛋白病1例报道[J].全科医学临床与教育,2014,04:465-467+481.
[49]周琛雯.任务型教学在高中英语阅读教学中实施情况的调查[D].扬州大学,学科教学,2012,硕士.
[50]施元.成钢公司螺纹钢市场营销战略研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.

相关推荐
更多