蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用

【摘要】目的：探讨蓝白斑筛选技术在生物医学方面的新应用：（1）TALENs（transcriptionactivator-likeeffectornucleases）活性检测和脱靶效应评估；（2）检测EGFR基因外显子19碱基缺失突变新方法。方法：设计合成一系列片段长度小于150bp的插入片段，将插入片段与两种T/A克隆载体（pGEM-TEasyvector和pTrueBluevector，具有不同的插入位点，分别位于密码子7和另一个是密码子11和36之间）连接，进行分子克隆，进一步观察菌落颜色并通过测序验证；人工构建基于蓝白斑筛选的含有TALENs靶序列的报告质粒，进一步提出一种原核水平检测TALENs有效性方法的可能性；设计一组特异性PCR引物，以样本DNA（如人工构建的EGFR野生型、突变型质粒、肿瘤组织DNA、血中游离DNA等）为模板进行PCR，进一步进行分子克隆。结合蓝白斑筛选，人为改变阅读框架，致使野生型阅读框架中含有终止密码子TAA，缺失突变型因丢失一段核酸片段而不含有终止密码子TAA，从而通过观察菌落的颜色来确定样品有无EGFR基因外显子19的碱基缺失突变。结论：基于两种不同插入位点的TA克隆载体（pGEM-TEasyvector和pTrueBluevector），若插入片段若是3的整数倍则菌落呈蓝色；若是3的非整数倍则菌落呈白色。因此，理论上插入或缺失突变若导致LacZ阅读框移码则呈现菌落蓝色变为白色的现象。成功构建2种含有TALENs靶序列的报告质粒，2种质粒的LacZ阅读框分别为移码与非移码，对应菌落颜色为白色、蓝色；在此基础上提出一种检测TALENs有效性的方法，即当TALENs特异性剪切蓝白斑筛选载体上的靶序列时，导致多肽阅读框的非移码与移码变换，从而共转化后菌落颜色改变。该体系还可广泛应用于锌指蛋白核酸酶（zincfingernucleases，ZFNs），CRISPR-cas系统（CRISPR–Cassystems）有效性检测。分别以人工构建的EGFR野生型、突变型质粒、肺癌肿瘤组织基因组DNA为模板进行PCR、分子克隆，结果显示野生型插入片段分子克隆的菌落为白色，突变型插入片段分子克隆的菌落为蓝色。
【作者】潘韵芝；
【导师】李凯；
【作者基本信息】苏州大学，药理学，2014，硕士
【关键词】蓝白斑筛选；TAcloning；反因子蛋白酶（TALENs）；EGFR基因；

【参考文献】
[1]郭靖.Cahn-Hilliard方程的二阶有限差分格式研究[D].苏州大学,计算数学,2012,硕士.
[2]龚清平.河台金矿采空区处理的探讨与实践[J].有色金属(矿山部分).2007(03)
[3]李超,王成红,宋苏,鲁仁全.自动化领域科学基金十年情况分析[J].自动化学报,2013,04:461-468.
[4]柳涛.腺苷诱发的成熟鼠胶状质细胞的突触后反应[D].江西医学院,儿科,2003,硕士.
[5]刘鹏.PHP Web应用程序安全性研究及安全漏洞检测工具开发[D].西安电子科技大学,密码学,2012,硕士.
[6]童成玲.消费信贷的经济效应分析[D].湖南师范大学,政治经济学,2013,硕士.
[7]谢君萍.基于Web技术的房地产销售管理系统的设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[8]贾军芳.壳聚糖/明胶互穿网络复合材料的制备及性能研究[D].武汉纺织大学,纺织化学与染整工程,2014,硕士.
[9]田颖.醋酸酯化马铃薯淀粉的制备及其贮存稳定性的研究[D].天津大学,应用化学,2003,硕士.
[10]马超.基于人工智能算法的QR码识别系统应用与比较[D].杭州电子科技大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[11]牛钊.基于C/S和B/S混合模式的城市公共交通非接触式IC卡收费系统的研究及实现[D].西安理工大学,电气工程,2003,硕士.
[12]张庆华.齿轮标准讲座(3)[J].组合机床与自动化加工技术.1992(06)
[13]舒娟娟.基于词性统计的中文文本零水印研究[D].湖南大学,信息与通信工程,2012,硕士.
[14]张甜.基于粒子滤波算法的经济周期拐点识别研究[D].华中科技大学,金融学,2012,硕士.
[15]李志鹏.国产比伐卢定对经桡动脉直接PCI治疗的急性心肌梗死患者治疗效果与安全性研究[D].河北医科大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[16]邢虹雨.印尼中小学生华语课堂开口率低原因探究[D].广东外语外贸大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[17]明明.中等职业技术学校英语隐性课程分析[D].西南大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[18]李俊琦.2型糖尿病患者夜间低血糖危险因素分析及对策研究[D].吉林大学,公共卫生,2012,硕士.
[19]张俊龙.网格环境下基于QoS的铁路信息服务组合优化研究[D].北京交通大学,系统工程,2013,硕士.
[20]耿春秋.不同情境下大学生的共情、人际信任、反馈对助人行为的影响[D].华中师范大学,应用心理学,2014,硕士.
[21]牛瑛奎.石油封隔器的仿真研究[D].西南交通大学,工程力学,2013,硕士.
[22]姜海.溢流阀、电磁换向阀产品质量分析[J].液压与气动.1992(02)
[23]袁兰.城市社区的文化生活与公共文化服务[D].华中师范大学,政治社会学,2013,硕士.
[24]肖鸿禹.产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统hdtS基因的克隆和功能分析[D].东北农业大学,微生物学,2013,硕士.
[25]黄肇伟.驰名商标淡化救济及竞争立法问题研究[D].华侨大学,经济法学,2004,硕士.
[26]舒根.湖南省建设体育强省战略研究[D].湖南师范大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[27]孔金平,王忠莉.非政府组织信任危机补救研究[J].行政论坛,2015,02:88-92.
[28]蔡雯卿.上海市A地区与英国英格兰地区教育督导的比较分析[D].华东师范大学,教育,2004,硕士.
[29]李剑能.人胎盘滋养细胞11β-羟基类固醇脱氢酶Ⅱ型表达调控的分子机制[D].复旦大学,生物物理学,2013,博士.
[30]向杰.可吸收诱导神经修复材料用于周围神经缺损的实验研究及初步临床应用[D].南方医科大学,骨外科学,2012,硕士.
[31]王韬.社会动员视野下的网络群体事件研究[D].内蒙古大学,新闻与传播学,2013,硕士.
[32]李成园.国际石油期货价格对我国石油股票价格影响的实证分析[D].首都经济贸易大学,统计学,2013,硕士.
[33]常宵莹.合作学习在大学英语阅读教学中的应用[D].渤海大学,课程与教学论,2014,硕士.
[34]俞菲.员工坚韧性与个体绩效关系的实证研究[D].北京林业大学,行政管理,2013,硕士.
[35]梁超.电针对脑缺血再灌注大鼠脑皮质局部血流量和血管新生的影响研究[D].湖北中医药大学,针灸推拿学,2014,博士.
[36]刘星彤.中国共产党对高校领导的体制变迁与完善[D].吉林大学,马克思主义发展史,2013,硕士.
[37]刘开丽.粒子群优化算法的研究与应用[D].安徽大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[38]齐洁,汪定伟.求解网络广告资源优化模型的改进微粒群算法[J].控制与决策,2004,08:881-884.
[39]涂兴峰.半乳凝素-1与肝癌转移的相关性研究[D].福建医科大学,外科学,2014,硕士.
[40]陈志.基于Magmasoft的低压铸造铝车轮模具开发环境研究[D].燕山大学,材料工程,2014,硕士.
[41]严超.全球定位基带处理SoC设计与关键技术研究[D].重庆大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[42]杨超.鄂尔多斯盆地奥陶系储层测井评价方法研究[D].长安大学,地质工程（专业学位）,2013,硕士.
[43]余衍然.轨道车辆平稳性的随机参数全局灵敏度分析[D].苏州大学,车辆工程,2014,硕士.
[44]李江.投融资体制改革与风险投资创新[D].东北财经大学,国民经济学,2003,硕士.
[45]马琦媛.电子购物网站的交互体验度研究[D].浙江大学,2008.
[46]朱红.早期西方马克思主义整体性问题研究[D].西安科技大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[47]黄鹂诗.基于SIMIO的机坪车辆调度仿真研究[D].南京航空航天大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[48]叶丹.2型糖尿病患者心率变异与下肢动脉病变关系[D].浙江大学,内科学,2004,硕士.
[49]周喜霞.中国外逃经济犯罪嫌疑人引渡的常规替代措施研究[D].新疆大学,国际法学,2013,硕士.
[50]张瑞生,李丁霞,高小盼,王波.基于元数据配置的订单展开方法及其应用[J].冶金自动化,2014,02:15-20+27.