α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂后处理对大鼠离体心肌细胞缺氧—复氧损伤的保护作用及其机制的实验研究

【摘要】背景过度的炎症反应是心肌缺血-再灌注损伤(ischemiareperflisioninjury,IRI)的重要发生机制之一。大量研究证实,适度的调控缺血-再灌注过程中的炎症反应能显著减轻心肌IRI,而且既往研究就发现迷走神经介导的胆碱能抗炎通路(cholinergicanti-inflammatorypathway,CAP)可有效的调控机体的炎症反应。本研究小组的前期工作亦证实,迷走神经电刺激后处理能通过抑制心肌IRI过程中的全身和心脏组织局部炎症反应而减轻心肌IRI。但是直接电刺激迷走神经仍是一种较为复杂的有创操作,并且设备费用较高。因此,寻找一种同样能激动CAP的药物实施替代治疗则更具临床应用前景。a7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nicotinicacetylcholinerreceptor,a7nAChR)是CAP中外周靶细胞接收迷走神经调控信号的感受器。其在识别和接受迷走神经下达的炎症反应调节信号后,将信息传递至细胞内部,进而产生一系列的生物学效应,最终达到免疫调节的作用。a7nAChR激动剂已广泛的应用于各类炎症相关性疾病的治疗研究中。据此我们选择特异性a7nAChR激动剂PNU282987替代直接的迷走神经电刺激后处理,观察其对缺血-再灌注心肌的保护作用。本实验前期的在体研究已初步证实了我们的实验设想,即PNU282987后处理同直接迷走神经电刺激后处理一样,亦能通过抑制IRI过程中的炎症反应而显著减轻心肌组织损伤。但是关于PNU282987后处理心肌保护作用的量效关系以及其保护作用机制目前尚未阐明。糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase-3p,GSK-3p)是真核生物中一种高度保守的多功能丝氨酸／苏氨酸激酶。研究证实激活GSK-3β是缺血-再灌注导致组织损伤的重要机制。活化后的GSK-3β通过放大炎症反应、开放线粒体通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,mPTP)以及激活多条促凋亡途径加剧组织损伤。抑制GSK-3β活性是多种内源性和外源性心肌保护干预措施的共同机制靶点。所以我们推测GSK-3β极有可能是CAP中a7nAChR激动剂PNU282987后处理心肌保护作用的重要机制点。mPTP过度开放导致线粒体膜电位不可逆性降低,并激活线粒体依赖性凋亡途径是心肌IRI的另一重要发生机制。采取各种措施抑制mPTP过度开放被证实能明显减轻心肌IRI。并且同炎症反应一样,mPTP亦受控于GSK-3p,那么炎症反应和mPTP开放状态在心肌IRI中的相互关系如何?明确这一点将有助于进一步明确a7nAChR激动剂PNU282987后处理的心肌保护作用机制,并且能更加全面的掌握心肌IRI的发生机制。鉴于上述分析,我们设计了这个随机对照离体细胞实验,研究的主要目的包括：①构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。②在离体细胞层面观察α7nAChR激动剂PNU282987后处理的心肌保护作用并阐明其量效关系；③观察GSK-3β在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位；④探究mPTP与炎症反应在心肌IRI中的相互关系,以及两者在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位和相互关系。第1部分新生鼠心肌细胞体外培养和离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型的建立本部分实验的目的是建立成熟、稳定和高质量的心肌细胞体外培养方法,并在此基础上采用厌氧法构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧(anoxia/reoxygention)损伤模型。采用0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型胶原酶混合多次消化法分离1-2dSD新生鼠心肌细胞,1h差速贴壁结合5-BrdU化学抑制法纯化心肌细胞。倒置相差显微镜镜下观察细胞活性并通过心肌肌钙蛋白T(CardiactroponiaT,cTnT)免疫荧光法复合细胞核4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidinedihydrochloride,DAPI)染色法鉴定心肌细胞纯度。采用厌氧培养法构建新生鼠离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。心肌细胞培养72h后,随机分为7组：Sham组(空白对照组),心肌细胞正常培养不进行任何处理；3h组,心肌细胞仅接受缺氧3h的处理；3h/6h组,心肌细胞接受缺氧3h和复氧6h的处理；6h组,心肌细胞仅接受缺氧6h的处理；6h/6h组,心肌细胞接受缺氧6h和复氧6h的处理；9h组,心肌细胞仅接受缺氧9h的处理；9h/6h组,心肌细胞接受缺氧9h和复氧6h的处理。实验结束后,采用专用的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)释放检测试剂盒检测各组心肌细胞LDH漏出率,膜联蛋白V/碘化丙啶(propidineiodide,PI)(AnnexinV/PI)双染流式细胞术检测心肌细胞凋亡情况。倒置相差显微镜下观察,心肌细胞活性高、收缩有力,48-72h出现同步化搏动,形成功能上的合胞体。cTnT免疫荧光法复合细胞核DAPI染色法鉴定心肌细胞纯度达到(94.2+2.0)%。与Sham组相比：3h组、3h/6h组、6h组、6h/6h组、9h组和9h/6h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均显著升高,正常细胞百分比显著降低。与3h组相比：6h组、9h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均显著升高,正常细胞百分比显著降低；但3h/6h组与3h组相比心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比差异均无统计学意义。与6h组相比：9h组和6h/6h组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比显著升高,正常细胞百分比显著降低。9h/6h组与9h组相比,心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比、晚期凋亡细胞百分比和正常细胞百分比差异均无统计学意义。第2部分不同浓度PNU282987后处理对离体大鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤及其炎症反应影响的实验研究本部分实验的目的是,评价不同浓度PNU282987后处理对离体心肌细胞缺氧-复氧损伤的作用及其对炎症反应的影响。根据对心肌细胞的不同处理,将其随机分为6组：空白对照组(Sham组),心肌细胞正常培养,仅在检测前6h加入与其它组相同浓度的二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide,DMSO);缺氧-复氧损伤对照组(AR组),复氧培养基中加入与其它组相同浓度的DMSO;3μMPNU282987后处理组(3μM组),复氧培养基中加入3μM的PNU282987;10μMPNU282987后处理组(10μM组),复氧培养基中加入10μM的PNU282987;30μMPNU282987后处理组(30μM组),复氧培养基中加入30μM的PNU282987;60μMPNU282987后处理组(60μM组),复氧培养基中加入60gM的PNU282987。实验结束时,检测心肌细胞LDH漏出率和细胞凋亡情况。并且采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测心肌细胞培养上清液白介素-6(interleukin-6,IL-6)与肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的浓度。结果显示,与Sham组相比：AR组、3μM组、101μM组、30μM组和60μM组心肌细胞LDH漏出率显著升高、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均显著升高、正常细胞百分比显著降低、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著升高。与AR组相比：3μM组、10μ,M组、30μM组和60μM组的心肌细胞LDH漏出率显著降低、正常细胞百分比显著升高、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著降低；10μM组、30μM组和60μM组的早期凋亡细胞百分比显著降低,而3μM组的早期凋亡细胞百分比差别无显著统计学意义；AR组、3μM组、10μM组、30μM组和60μM组的晚期凋亡细胞百分比差别无显著统计学意义。与3μM组相比：10μM组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比显著降低,正常细胞百分比显著升高,心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-a浓度显著降低。与10μM组相比：30μM组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比显著降低,正常细胞百分比显著升高,心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度显著降低。但是与30μM组相比：60μM组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比显著升高,正常细胞百分比显著降低,心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度显著降低。第3部分GSK-3β在PUN282987后处理心肌保护作用机制中地位的实验研究根据前面第2部分实验的结果,在确定PUN282987后处理心肌保护作用最佳剂量的基础上,设计这部分实验,其目的是探讨GSK-3β在PUN282987后处理心肌保护作用机制中的地位。根据对心肌细胞的不同处理,将其随机分为4组：空白对照组(Sham组),心肌细胞正常培养,仅在检测前6h加入与其它组相同浓度的DMSO；缺氧-复氧损伤对照组(AR组),复氧培养基中加入与其它组相同浓度的DMSO；GSK-3β抑制剂TDZD-8后处理组(TDZD-8组),复氧培养基中加入10μM的TDZD-8;PNU282987后处理组(PNU282987组),在复氧培养基中加入30μM的PNU282987。实验结束时,检测各组心肌细胞LDH漏出率、细胞凋亡情况和心肌细胞培养上清液IL-6与TNF-a浓度。采用免疫蛋白印迹分析(、Vestern-blotting)技术检测各组心肌细胞GSK-3β与p-GSK-3pSer9,NF-κBp65与p-NF-κBp65Ser536蛋白的表达量；罗丹明123(Rhodamine123)染色流式细胞术与激光扫描共聚焦显微镜技术共同检测心肌细胞线粒体膜电位的变化。结果显示,与Sham组相比：AR组、TDZD-8组和PNU282987组心肌细胞LDH漏出率显著升高、正常细胞百分比显著降低、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均显著升高；心肌细胞GSK-3β蛋白表达量差异无统计学意义,而p-GSK-3pSer9蛋白表达量显著升高；心肌细胞NF-κBp65和p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量同时升高；心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著升高；心肌细胞线粒体膜电位显著降低。与AR组相比：TDZD-8组和PNU282987组LDH漏出率显著降低、正常细胞百分比显著升高、早期凋亡细胞百分比显著降低,而晚期凋亡细胞百分比差异无显著统计学意义；p-GSK-3pSer9蛋白表达量显著升高；NF-κBp65差异无统计学意义,而p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量显著降低；心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著降低；线粒体膜电位显著升高。与TDZD-8组相比：PNU282987组的心肌细胞LDH漏出率显著升高、正常细胞百分比显著降低、早期凋亡细胞百分比显著升高；P-GSK-3pSer9蛋白表达量显著降低、p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量显著升高；心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度显著升高；心肌细胞线粒体膜电位显著降低。第4部分mPTP和炎症反应在PUN282987后处理心肌保护作用中的地位及其相互关系的实验研究在前面第3部分实验的基础上,进一步探讨mPTP功能状态和炎症反应在心肌细胞缺氧-复氧损伤中的作用与相互关系,以及两者在PNU282987后处理心肌保护作用中的地位和相互关系。根据对心肌细胞的不同处理,将其随机分为6组：空白对照组(Sham组),仅在检测前6h加入与其它组相同浓度的DMSO；缺氧-复氧损伤对照组(AR组),复氧培养基中加入与其它组相同浓度的DMSO;PNU282987后处理组(PNU282987组),复氧培养基中加入30μM的PNU282987;mPTP开放抑制剂环孢素A(CiclosporinA,CSA)后处理组(CSA组),复氧培养基中加入1μtM的CSA;mPTP开放剂苍术苷(atractyloside,ATR)后处理组(ATR组),复氧培养基中加入20μM的ATR以及与其它实验组相同浓度的DMSO;PNU282987复合ATR后处理组(P+A组),复氧培养基中加入30μM的PNU282987和20μM的ATR。实验结束时,检测各组心肌细胞LDH漏出率、细胞凋亡情况、NF-κBp65与p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量、心肌细胞培养上清液IL-6与TNF-α浓度和心肌细胞线粒体膜电位。结果显示：与Sham组相比：AR组、PNU282987组、CSA组、ATR组和P+A组心肌细胞的LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比和晚期凋亡细胞百分比均显著升高,正常细胞百分比显著降低；NF-κBp65和p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-P浓度均显著升高；心肌细胞线粒体膜电位显著降低。与AR组相比：]NU282987组、CSA组和P+A组的早期凋亡细胞百分比显著降低,正常细胞百分比显著升高；心肌细胞p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著降低。此外,与AR组相比,PNU282987组和CSA组心肌细胞LDH漏出率亦显著降低、线粒体膜电位亦显著升高。ATR组与AR组相比：心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比显著升高,正常细胞百分比显著降低；心肌细胞p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-a浓度均显著升高；心肌细胞线粒体膜电位显著降低。AR组、PNU282987组、CSA组、ATR组和P+A组心肌细胞晚期凋亡率与NF-κBp65蛋白表达量组间差异无统计学意义。PNU282987组与CSA组相比：心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比以及正常细胞百分比差异无统计学意义。但PNU282987组心肌细胞的p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量和心肌细胞培养上清液IL-6与TNF-α浓度显著低于CSA组；而CSA组心肌细胞线粒体膜电位显著高于PNU282987组。HPNU282987组相比：P+A组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比显著升高,正常细胞百分比显著降低；心肌细胞p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著升高；心肌细胞线粒体膜电位显著降低。与ATR组相比：P+A组心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比显著降低,正常细胞百分比显著升高；心肌细胞p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量、心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α浓度均显著降低；心肌细胞线粒体膜电位显著升高。析因分析结果显示,PNU282987后处理和ATR后处理对缺氧-复氧心肌细胞LDH漏出率、早期凋亡细胞百分比、正常细胞百分比以及心肌细胞培养上清液IL-6和TNF-α的影响有明显的相互拮抗作用。而两者对心肌细胞p-NF-κBp65Ser536蛋白表达量和线粒体膜电位的作用则表现为相加作用。结论通过本实验,我们得出以下结论：1.通过缺氧6h/复氧6h处理能够成功建立离体心肌细胞缺氧-复氧损伤模型。2.不同浓度的PNU282987后处理均可抑制离体心肌细胞缺氧-复氧损伤过程中的炎症反应,并产生明显的心肌保护作用。PNU282987后处理的炎症反应抑制作用存在有剂量-效应关系,但是其心肌保护作用存在“封顶效应”,在30μM时达到最强。3.PNU282987后处理和TDZD-8后处理均能通过抑制缺氧-复氧心肌细胞GSK-3β活性而显著降低炎症反应和mPTP开放程度,并产生明显的心肌保护效应。并且TDZD-8后处理的心肌保护作用强于PNU282987后处理。4.mPTP开放状态能显著影响缺氧-复氧心肌细胞损伤的程度,并主动参与炎症反应。表现为mPTP开放抑制剂CSA能显著降低心肌细胞缺氧-复氧过程中的炎症反应,维持心肌细胞线粒体膜电位,产生明显的心肌保护作用；而mPTP开放剂ATR则能显著上调此过程中的炎症反应水平,降低心肌细胞线粒体膜电位,显著加重缺氧-复氧心肌细胞的损伤程度。5.mPTP过度开放能显著拮抗PNU282987后处理的心肌保护作用及其下调炎症细胞因子IL-6和TNF-a释放的作用。同时,PNU282987后处理亦能显著拮抗mPTP开放剂ATR后处理加重心肌细胞损伤及其上调IL-6和TNF-a释放的作用。6.除了抑制mPTP开放介导的细胞凋亡途径之外,PNU282987后处理还存在其它的抗细胞凋亡途径。
【作者】程怡；
【导师】薛富善；
【作者基本信息】北京协和医学院，麻醉学，2014，博士
【关键词】心肌细胞缺氧-复氧损伤；胆碱能抗炎通路；α7烟碱型乙酰胆碱受体；糖原合成酶激酶3β；线粒体通透性转换孔；

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