垂体ACTH腺瘤全转录组深度测序及患者临床表型—基因型关联分析研究

【摘要】背景：垂体腺瘤(pituitaryadenomas)发病率居颅内肿瘤第二位,人群发病率约为20%。目前基于临床表现、内分泌激素测定及免疫组织化学检测,将其分为：无功能腺瘤、泌乳素腺瘤、生长激素腺瘤、促肾上腺素腺瘤和促甲状腺激素等五种类型。但是,这种基于肿瘤的细胞形态学、内分泌学、影像学等常规临床资料的组织病理学分型并不能揭示肿瘤发生发展、侵袭生长和肿瘤所致神经-内分泌紊乱等生物学习性的分子机理,更不能精准地指导临床诊治和预后判断。因此,如何从肿瘤组学水平重新对垂体腺瘤进行分子病理分型,成为目前垂体腺瘤研究领域亟待解决的问题。本研究拟利用新一代测序技术平台(Nextgenerationsequencing,NGS),对垂体ACTH腺瘤全转录组进行高通量测序,在转录组水平筛选相关差异表达基因和小RNA；与患者临床表型进行关联分析,探究垂体ACTH腺瘤所致临床表型的分子机理,以期最终建立垂体腺瘤分子病理新分型,实现垂体腺瘤患者个性化治疗。第一部分：经蝶窦入路手术治疗118例垂体ACTH腺瘤患者临床表型-表型关联分析研究目的：回顾分析经蝶窦入路手术治疗的垂体ACTH腺瘤患者临床信息,探究各临床表型的关联性。方法：收集2012年5月至2013年7月经蝶窦入路手术治疗的垂体ACTH腺瘤患者临床信息,重点采集患者典型临床表现、内分泌相关检查、血常规检查、肝肾功能、电解质、糖脂代谢,手术治疗技巧等共106项临床指标,采用临床表型-表型关联分析的方法,探究各临床指标的相关性。结果：共收集经蝶窦入路手术治疗垂体ACTH腺瘤患者118例,且入院前未接受过与库欣病相关的手术、药物及放疗治疗。其中女性101例,男性17例,男女比例1：5.9。年龄介于14～65岁,平均年龄35.5±12.3岁。病程2个月至19年,平均4.0年。术前内分泌学检查：患者均见血皮质醇水平增高(标准方差：实验组36.6±16.7ug/dl,验证组34.4±11.5ug/dl),昼夜节律消失；24h尿游离皮质醇升高(标准方差：实验组417.1±421.2ug/24hr,验证组576.5±559.9ug/24hr)；地塞米松抑制试验：小剂量(2mg)不抑制97%(114/118例)；大剂量(8mg)抑制89.5%(105/118例)。术前增强垂体MRI肿瘤平均最大直径：7.6±6.4mm；双能X线(DEXA)骨密度检查：骨质疏松发生率53.4%(63/118例),病理性骨折28.0%(33/118例)。术中瘤周垂体切除率：44.9%(53/118例)。垂体ACTH腺瘤MRI增强扫描下肿瘤最大直径与库欣病患者骨质疏松程度呈线性正相关。结论：垂体ACTH腺瘤肿瘤大小和患者骨质疏松呈线性正相关,除所知高皮质醇血症对骨代谢的影响外,或许存在肿瘤发生与骨代谢调节的其他分子机制,需要我们进一步加强相关基础研究。第二部分：垂体ACTH腺瘤转录组深度测序及患者临床表型-基因型关联分析研究目的：运用新一代测序技术对垂体ACTH腺瘤行转录组测序,探究肿瘤发生与各临床表型之间可能的分子调节机制。方法：收集单一中心118例垂体ACTH患者的组织标本(肿瘤及瘤周垂体),同时采集患者相关临床信息106项。运用新一代测序技术对9对配对样本(肿瘤和瘤周组织)进行转录组深度测序,获取垂体ACTH腺瘤差异表达基因谱。运用皮尔逊相关性分析基因型-临床表型关联性,探究其内在可能分子调节机制。结果：在临床表型-基因型关联分析中,库欣病肿瘤大小与骨代谢指标的相关性被凸显出来；运用皮尔逊关联分析,从肿瘤差异表达基因谱中获得一系列与骨代谢相关基因。通过文献挖掘,发现大部分基因已有报道与骨代谢相关,客观印证课题分析方法的可靠性。我们挑选未经报道的SPP1,COL1A1,NT5E,HTRA1和ANGPT1五个基因,进一步验证验证,并初步分析了这个五个基因在库欣病所致骨质疏松中的可能信号调节机制。结论：研究结果提示垂体ACTH腺瘤基因的差异表达,参与影响患者骨代谢,其信号网状调节在患者骨质疏松的发展中有重要作用。第三部分：基于全转录组深度测序的垂体ACTH腺瘤microRNAs差异表达分析目的：运用新一代测序技术,解析垂体ACTH腺瘤microRNA差异表达谱。方法：经蝶窦入路手术治疗库欣病患者,术中收集垂体ACTH腺瘤患者肿瘤标本及瘤周垂体组织共9对。运用IlluminaHiSeq2000,36SE全转录组microRNA测序,结合生物信息学分析筛查垂体ACTH腺瘤差异表达的microRNA谱。结果：所有9对样品建库成功,IlluminaHiSeq2000,36SE深度测序平均读取10M/样品。我们发现,垂体ACTH腺瘤与瘤周垂体相比(FC>2,Recurrence≥5),有67个microRNA显著差异表达,其中39个microRNA上调,28个microRNA下调。结论：前期实验结果表明microRNA的差异表达参与垂体ACTH肿瘤的发生。
【作者】杨亚坤；
【导师】王任直；蒋澄宇；
【作者基本信息】北京协和医学院，神经外科（专业学位），2014，博士
【关键词】垂体ACTH腺瘤；经蝶窦手术；临床表型分析；骨质疏松；表型-基因型关联分析；microRNA；二代测序；

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