趋化因子SDF-1α介导的胰腺星形细胞促胰腺癌细胞化疗耐药作用及其机制研究

【摘要】虽然过去数十年来胰腺导管腺癌(Pancreaticductaladenocarcinoma,PDAC)的基础与临床研究取得了丰硕的成果,但是胰腺癌治疗仍是世界性的医学难题。胰腺癌对放化疗高度耐药是其预后不佳的主要原因之一。大量临床研究表明即使采用健择(Gemcitabine,GEM)单独以及与其它化疗药物联用的各种治疗方案也不大可能明显改善胰腺癌的预后,而且还往往伴随着更大的毒性。因此,新的治疗策略的探索就显得非常的必要,靶向性治疗与传统化疗的联合应用可能是有效且可行的解决方案。对于胰腺癌来说,开发出与GEM联合应用的靶向药物是目前研究的重点与热点。传统的胰腺癌研究模式将焦点集中于胰腺癌细胞本身,忽略了肿瘤微环境对胰腺癌细胞的影响,这可能是现阶段绝大多数针对胰腺癌细胞的靶向治疗策略效果欠佳的重要原因之一。肿瘤微环境是肿瘤周围复杂的细胞生态系统,与肿瘤细胞的生长、迁移、转移、和放化疗耐药性都有密切关系。胰腺星形细胞(pancreaticstellatecell,PSC)是胰腺癌微环境中的关键性细胞。正常胰腺组织内PSC呈静止状态,胰腺癌发生后PSC活化,变成胰腺癌相关星形细胞(pancreaticcancerassociatedpancreaticstellatecell,Pa-PSC)。PSC活化、增殖产生大量细胞外基质及可溶性因子,导致PDAC间质内大量纤维结缔组织增生(desmoplasia),后者是PDAC最具特征性的组织病理学改变之一。PSC与胰腺癌细胞间的相互作用是近年来PDAC研究的热点领域,开辟了胰腺癌细胞与分子生物学研究的新模式,为胰腺癌靶向治疗带来了曙光。在本研究中,我们进行活化PSC与静止PSC间的差异表达基因谱检测,筛选出在活化PSC中高表达的细胞因子SDF-1α(又称CXCL12)并通过传统检测手段验证SDF-1α在活化PSC中的表达,进而探讨PSC旁分泌因子SDF-1α对胰腺癌细胞GEM耐药的影响与机制,进一步阐明PSC与胰腺癌细胞间的相互作用机制,为针对肿瘤微环境的胰腺癌治疗策略提供潜在治疗靶点。本研究主要做了以下几个方面的研究：一、活化PSC与静止PSC间差异表达基因的筛选1.本研究采用outgrowth法从胰腺癌组织中原代培养活化PSC,并通过a-SMA、Vimentin免疫荧光进行了验证。2.利用全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)处理活化状态的PSC,使其发生去活化。根据细胞形态及油红O、a-SMA染色进行验证。3.利用GeneChip(?)HumanTranscriptomeArray2.0芯片筛选活化及静止PSC中差异表达的基因。4.通过使用生物信息学数据库对差异基因进行了功能注释,及主要信号通路的分析。5.利用传统检测方法验证SDF-1α在活化PSC中的表达水平显著高于静止PSC。二、证实活化PSC对胰腺癌细胞化疗耐药性的影响由SDF-1α介导1.在4例原代培养的活化PSC及4种胰腺癌细胞系中,检测SDF-1α及其特异性受体CXCR4的表达水平,并选择CXCR4高表达SDF-1αt低表达的Pane-1细胞作后续研究中采用的细胞系。2.通过MTT试验,验证PSC条件培养基(PSC-conditionedmedium,PSC-CM)可以降低GEM对Pane-1的细胞毒性。3.利用PSC-CM和SDF-1α中和抗体(SDF-laAb)处理Pane-1细胞,通过Hoechst染色及流式AnnexinV-FITC/PI法验证了SDF-1α介导了PSC对GEM诱导的Pane-1细胞凋亡的抑制作用。三、SDF-1a能够通过上调Pane-1细胞中IL-6的表达抑制GEM诱导的Pane-1细胞凋亡1.人重组蛋白SDF-1α可以上调Pane-1细胞中IL-6及IL-8的mRNA表达水平,IL-6表达水平的升高尤为显著,且SDF-1α中和抗体处理可以显著抑制SDF-1α诱导的Panc-1中IL-6mRNA及蛋白水平的升高。2.CXCR4特异性拮抗剂AMD3100处理可以抑制SDF-1α诱导的Pane-1细胞中IL-6mRNA及蛋白水平的升高。3.Hoechst染色观察细胞凋亡时细胞核形态的改变,结果显示,相对于GEM处理组及GEM+SDF-1α+IL6Ab组,GEM+SDF-1α组细胞凋亡比例显著减少。4.AnnexinV-FITC/PI法检测细胞的早期与晚期凋亡。结果显示,GEM处理组及GEM+SDF-1α+IL6Ab组的早期凋亡细胞比例均显著增加,与GEM+SDF-1α组相比具有统计学差异。四、SDF-1α经由活化FAK/AKT以及ERK1/2信号通路上调Panc-1细胞中IL-6表达1.利用人重组SDF-1α蛋白处理Panc-1细胞,Westernblot检测细胞内FAK、AKT以及ERK1/2的磷酸化水平,结果显示SDF-1α可以促进FAK,AKT以及ERK1/2的磷酸化水平。2.利用Westernblot方法检测FAK特异性抑制剂PF573228处理对SDF-1α诱导的Pane-1细胞内FAK、KT、ERK1/2磷酸化水平的影响。结果显示PF573228可以减少SDF-1α诱导的FAK、AKT磷酸化,但不影响ERK1/2磷酸化水平。3.利用Real-timePCR及ELISA方法检测PD98059(ERK1/2特异性抑制剂)、PF57322(FAK特异性抑制剂)处理分别对SDF-1α诱导的Panc-1细胞IL-6表达的影响,结果显示,PD98059与PF573228均能抑制SDF-1α诱导的Panc-1细胞IL-6上调。总之,本研究显示,活化的PSC能够促进胰腺癌细胞发生GEM化疗耐药。其机制可能为：活化的PSC高表达SDF-1α,以旁分泌的方式作用于胰腺癌细胞,经由SDF-1α/CXCR4生物轴活化胰腺癌细胞内的FAK-AKT及ERK1/2信号通路,上调胰腺癌细胞中IL-6的表达水平,最终通过IL-6自分泌环介导胰腺癌细胞发生GEM耐药。我们的研究结果表明,PSC与胰腺癌细胞相互作用的研究可能成为胰腺癌化疗耐药研究新的突破点,能够更加贴切地模拟人体内胰腺癌的真实环境；SDF-1α/CXCR4生物轴及其活化的下游胰腺癌细胞内信号通路是重要潜在的胰腺癌治疗靶点,针对SDF-1α/CXCR4生物轴的靶向治疗策略与GEM协同作用可能改善胰腺癌的治疗效果。
【作者】张卉；
【导师】刘彤华；梁智勇；
【作者基本信息】北京协和医学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】胰腺癌；胰腺星形细胞；化疗耐药；凋亡；SDF-1；IL-6；

【参考文献】
[1]刘华瑄,刘东甲,卢志堂,陶俊,姜静.桩基三维弹性波动方程变步长交错网格有限差分数值计算[J].岩土工程学报-7.
[2]刘德志.城市火灾报警智能监控终端的研究与应用[D].广东工业大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[3]黄友.基于二次相对评价法的外资并购沪深两市上市公司绩效研究[D].浙江工业大学,国际贸易学,2012,硕士.
[4]臧静.CD36单核苷酸多态性与老年动脉粥样硬化性脑梗死的相关性研究[D].山东大学,老年医学,2013,硕士.
[5]徐建军.地埋管地源热泵系统的水力平衡与优化[D].山东建筑大学,制冷及低温工程,2013,硕士.
[6]李智勇.面向绿色制造的齿轮滚切加工工艺规划及其应用[D].重庆大学,机械工程,2003,硕士.
[7]杨丽娟.几类微分方程非平凡解的存在性[D].曲阜师范大学,基础数学,2013,硕士.
[8]李志.TEA阻断BKCa离子通道对血管平滑肌细胞增殖的影响及机制的研究[D].广西医科大学,心血管内科（专业学位）,2013,硕士.
[9]温志学.关于企业入世应对策略的思考[D].河北大学,世界经济,2003,硕士.
[10]邹爱美.生物富集/细胞萃取在痕量重金属分离富集及形态分析中的应用研究[D].东北大学,2008.
[11]陈小艳,汪励,沈洁,许文稼.骨干院校建设背景下高职校企合作模式的探索与实践[J].黑龙江教育学院学报,2014,07:37-39.
[12]江雪梅.α-β-非扩张映射的不动点定理和带误差的隐式迭代序列的收敛定理[D].西南大学,基础数学,2014,硕士.
[13]张勇,苑森淼.一种新的多级关联规则高效挖掘算法[J].东北师大学报(自然科学版),2003,02:15-20.
[14]孙长军,张顶立.CRD法暗挖隧道下穿既有线施工沉降控制技术[J].市政技术,2015,02:97-101.
[15]胡海涛.汉代私学教育及特点[D].青海师范大学,中国古代史,2012,硕士.
[16]方勇,杨成梧.一般模型2-D系统干扰解耦观测器设计[J].自动化学报,1997,03:127-131.
[17]张远.六神丸对食管癌细胞浸润转移的影响及其相关机制的研究[D].湖南中医药大学,中西医结合临床,2013,硕士.
[18]孙红红.滴灌条件下土壤水吸力与灌水频率对马铃薯生长及营养吸收的影响[D].甘肃农业大学,作物栽培学与耕作学,2003,硕士.
[19]周广鹤.中庭空间中天窗形态的生成逻辑[D].北京建筑大学,建筑学,2013,硕士.
[20]王荣盛.民航东北空管局网络办公系统设计与实现[D].大连理工大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[21]黄志.重庆市竞技体育可持续发展研究[D].西南大学,体育人文社会学,2013,硕士.
[22]李媛.我国商业银行海外并购对比案例研究[D].山东财经大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[23]纵雅婷.制度环境、政治关联与银行贷款[D].安徽大学,企业管理,2013,硕士.
[24]李明明.当归多糖抑制正常大鼠及慢性炎症贫血（ACD）大鼠hepcidin表达的研究[D].华中科技大学,药剂学,2013,硕士.
[25]郭修瑞.浙江莲都农村合作银行信贷风险管理研究[D].天津大学,高级工商管理,2013,硕士.
[26]田松,张凤鸣,苏恩泽,惠晓滨.基于仿真的装备管理概念下的协同决策研究[J].控制与决策,2003,03:300-303+308.
[27]巩彦斌.错误记忆提取阶段的激活和监测及老化研究[D].天津师范大学,发展与教育心理学,2014,博士.
[28]王智化,李谦,刘敬,黄镇宇,周志军,周俊虎,岑可法.准东煤中碱金属的赋存形态及其在热解过程中的迁移规律[J].中国电机工程学报,2014,S1:130-135.
[29]田燕.审美神义论与清教神义论[D].四川外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[30]刘文涵,袁荣辉,滕渊洁.金电极上2,3-二巯基丁二酸镍配合物修饰膜的化学特性研究[J].光谱学与光谱分析,2014,12:3345-3349.
[31]郭朝先.中国二氧化碳排放增长因素分析——基于SDA分解技术[J].中国工业经济,2010,12:47-56.
[32]赵晓春.瞿秋白人格研究[D].华东师范大学,基础心理学,2003,硕士.
[33]周霞.单元生产方式在装配线的应用研究[D].广东工业大学,工业工程（专业学位）,2013,硕士.
[34]吴昊.搜索引擎服务市场垄断问题研究[D].西南政法大学,经济法（专业学位）,2012,硕士.
[35]谢守红.英语主从复合结构的象似性研究[D].四川外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[36]张博.城市污水中肠杆菌的抗生素耐药性和多种耐药基因的检测[D].东北农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[37]沈家兴.艾灸法治疗心脾两虚型失眠的临床研究[D].广州中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[38]高扬.英汉公共话语中语法隐喻对比分析[D].天津理工大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[39]李灼.含氮、氧、硫有机自由基体系的非线性光学性质的理论研究[D].东北师范大学,2013.
[40]严华云.数据挖掘技术及其在网络环境中的应用研究[D].昆明理工大学,2003.
[41]金月.线控液压转向试验台的电液加载系统的研究[D].南京农业大学,机械工程,2013,硕士.
[42]李娜.大学计算机考试系统前台管理的研究与实现[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[43]牛丽华.钢管混凝土风电塔架K型焊接管板节点的力学性能研究[D].内蒙古科技大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[44]郑艳军.西藏盐湖稀有金属开发利用研究[D].中国地质大学（北京）,管理科学与工程,2014,硕士.
[45]李映笙.激光共焦生物芯片扫描仪中的图像重建与分析[D].浙江大学,光学工程,2004,硕士.
[46]孙文.非线性发展方程的求解及对称研究[D].辽宁师范大学,应用数学,2012,硕士.
[47]陈明.基于STM32的嵌入式web服务器的设计[D].武汉理工大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[48]张志恒.基于粗糙集理论的企业财务危机预测模型及实证研究[D].重庆大学,2003.
[49]郭伟华.VSD配合无菌中药冲管在治疗四肢严重软组织损伤创面的（湿热蕴毒证）的临床研究[D].湖南中医药大学,中医学,2014,硕士.
[50]张弛.国产男、女士香烟纸盒包装设计差异[J].艺术教育,2014,07:192.