Bmi-1调控人胆囊癌细胞增殖的效应及其WWOX信号通路的分子机制

【摘要】[研究目的]1.探讨Bmi-1、WWOX及PUMA基因在胆囊癌组织和慢性胆囊炎伴轻-中度非典型增生组织及正常胆囊组织中的表达差异,分析Bmi-1/WWOX/PUMA表达与胆囊癌临床病理因素的关系,有望揭示其表达差异在胆囊癌发生、发展中的作用及其临床意义,为后续研究胆囊癌的发生机制奠定基础。2.通过体外RNAi干扰技术成功构建靶向shRNA-Bmi-1重组载体抑制原癌基因Bmi-1表达,观察其对胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的效应,探讨Bmi-1调控WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2/Caspase-3信号通路调节胆囊癌细胞生长的分子机制。3.通过体外成功构建pcDNA3.0-WWOX真核表达载体,探讨过表达WWOX基因对胆囊癌细胞增殖,凋亡及细胞周期的影响,进一步研究WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路调控胆囊癌细胞生长的分子机制,为研究Bmi-1/WWOX通路间是否存有反馈环路奠定基础。4.成功建立了人胆囊癌BALB/C裸鼠皮下移植瘤模型,通过体内试验评估靶向抑制Bmi-1对移植瘤的治疗效果,进一步探讨其对胆囊癌细胞生长的影响及调控Bmi-1/WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路的分子机制,验证体外实验结果。5.本课题通过临床相关研究,体外及裸鼠体内试验研究,全面系统阐述Bmi-1调控人胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的效应及其WWOX信号通路的分子机制,将有助于胆囊癌标志物的筛选及病情的预后和评估,为胆曩癌的早期诊断、分子靶向治疗提供理论依据和实验数据。[研究方法]1.临床相关研究：收集临床病理资料完整的原发性胆囊腺癌病人手术标本存档石蜡块55例,收集同期慢性胆囊炎伴轻-中度非典型增生组织标本30例及正常胆囊组织标本22例(均来自于肝内胆管结石或肝脏肿瘤行右半肝切除患者,胆囊内无结石及肿瘤侵袭)作对照,其中每组病例包括新鲜组织各5例。应用IHC-MaxVision法、RT-PCR及Real-timePCR等技术检测上述标本中Bmi-1/WWOX/PUMAmRNA及蛋白的表达差异,分析三者表达与胆囊癌临床病理因素的关系及意义。2.体外研究,以原癌基因Bmi-1mRNA为靶点：通过体外RNAi干扰技术成功构建shRNA-Bmi-1重组载体转染胆囊癌GBC-SD细胞,应用倒置荧光显微镜及流式细胞技术评价其转染效率,以RT-PCR及Westernblot检测转染后胆囊癌细胞转录和翻译水平的变化,筛选出最佳干扰作用的Bmi-1靶序列重组质粒为后续实验组。通过倒置显微镜观察、Brdu实验、AnnexinV/7-AAD单染和双染实验、透射电镜及细胞周期检测技术分析靶向shRNA抑制Bmi-1对胆囊癌细胞增殖活性、凋亡进程及细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系,进一步通过Real-timePCR,WesternBlot,免疫荧光染色及流式细胞检测等技术探讨靶向shRNA抑制Bmi-1表达对WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2/Caspase-3通路影响的分子机制。3.体外研究,以抑癌基因WWOXmRNA为靶点：提取GBC-SD细胞总RNA,采用RT-PCR扩增WWOX全序列,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.0中,通过限制性内切酶酶切及DNA测序鉴定,成功构建pcDNA3.0-WWOX重组真核表达载体。按脂质体介导转染GBC-SD细胞,同时转染空载体、脂质体为阴性对照及GBC-SD细胞为空白对照。以RT-PCR、Westemblot及免疫荧光技术检测转染后胆囊癌细胞转录和翻译水平的变化,以MTT法、AnnexinV/7-AAD双染、TUNNEL法、细胞周期检测技术、透射电镜技术、线粒体跨膜电位检测技术分析过表达WWOX对胆囊癌细胞增殖活性、凋亡及细胞周期的影响机制及其生物学效应与时间梯度的关系,进一步通过Real-timePCR,WesternBlot,免疫荧光染色及流式细胞检测等技术探讨pcDNA3.0-WWOX真核表达载体对WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路调控的分子机制。4.体内试验研究：以体外实验结果为基础,通过建立人胆囊癌BALB/C裸鼠皮下移植瘤模型,应用shRNA-Bmi-1重组质粒在移植瘤周围及瘤内多点注射,实验终止绘制移植瘤生长曲线,计算瘤体抑制率,通过标本解剖和组织病理检测手段探讨靶向shRNA抑制Bmi-1表达对裸鼠皮F移植瘤的抗瘤效果,通过MaxVision去、TUNEL法、透射电镜、RT-PCR及WesternBlot等检测技术进一步探讨Bmi-1对胆囊癌细胞生长的影响及调控WWOX通路关键基因表达的分子机制。[研究结果11.临床相关研究结果(1)IHC-MaxVision检测结果显示：Bmi-1、WWOX及PUMA蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达分别为83.6%(46/55)、38.2%(21/55)和34.5%(19/55),其中Bmi-1蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达明显高于慢性胆囊炎伴非典型增生组织及正常胆囊组织,而WWOX及PUMA蛋白在胆囊癌组织中的阳性表达明显低于慢性胆囊炎伴非典型增生组织及正常胆囊组织(P<0.05)。(2)Bmi-1、WWOX及PUMA表达差异与临床病理因素的关系结果：Bmi-1、WWOX蛋白表达水平与胆囊癌的病理分期、分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05),与胆囊癌患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、是否伴有肝硬化及胆囊结石无相关性(p>0.05)。PUMA蛋白表达水平与胆囊癌分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤大小、临床病理分期、肿瘤部位、是否伴有肝硬化及胆囊结石均无相关性(p>0.05)。(3)RealtimePCR和RT-PCR检测结果：Bmi-1mRNA表达为胆囊癌组织>慢性胆囊炎伴非典型增生组织>正常胆囊组织；而WWOX及PUMAmRNA表达为胆囊癌组织<慢性胆囊炎伴非典型增生组织<正常胆囊组织(P<0.05)。实验表明Bmi-1、WWOX及PUMA基因可能参与胆囊癌发生、发展过程,慢性胆囊炎伴非典型增生组织中Bmi-1持续高表达或WWOX/PUMA持续低表达警示胆囊癌发生的可能。2.以原癌基因Bmi-1mRNA为靶点的体外研究结果(1)shRNA-Bmi-1重组载体的构建及筛选结果：shRNA-Bmi-1重组载体构建后经基因测序证明所获得的4组Bmi-1基因扩增序列正确。应用倒置荧光显微镜及流式细胞技术检测细胞转染效率70%左右；将4组质粒分别转染胆囊癌GBC-SD细胞48h后,通过RT-PCR及Westernblot检测筛选出第四组序列在转录和翻译水平抑制显著,为后续实验组(即为shRNA-Bmi-1组)。(2)靶向shRNA干扰Bmi-1表达对胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响结果：通过RT-PCR及Westernblot检测显示靶向抑制Bmi-1,其mRNA及蛋白表达水平均明显低于对照组(p<0.05)；而对照组间表达量无显著差异(p>0.05)。倒置显微镜观察发现shRNA-Bmi-1对胆囊癌细胞的影响随时间的推移,增殖抑制率较对照组明显,其中以转染后72h抑制效果最显著,细胞死亡最多。Brdu检测显示shRNA-Bmi-1组细胞增殖活性较对照组降低,细胞增殖力呈时间依存性,随时间推移增殖力明显减弱,于转染72h细胞增殖抑制最强(p<0.05)。AnnexinV/7-AAD单染和双染检测显示转染shRNA-Bmi-1重组质粒24h-48h-72h后,shRNA-Bmi-1组细胞凋亡率均随时间推移明显增加(24h<48h<72h),且与晚期凋亡增加为主(p<0.05)。透射电镜检测发现shRNA-Bmi-1转染组胆囊癌细胞浓缩、核固缩形成凋亡小体。细胞周期检测显示shRNA-Bmi-1转染组G0/G1期细胞增多,G2/M和S期细胞减少,细胞阻滞于G0/G1,细胞凋亡率明显增高,增殖指数降低(p<0.05)。(3)靶向shRNA干扰Bmi-1表达调控WWOX通路的分子机制研究结果：通过Real-timePCR、WesternBlot及免疫荧光染色技术检测显示shRNA-Bmi-1转染组胆囊癌细胞Bmi-1mRNA及蛋白表达量及蛋白荧光强度较对照组减少,而WWOX、P73、PUMAmRNA及蛋白表达量较对照组均明显增加,蛋白荧光表达强度明显增强(p<0.05)；流式细胞仪技术检测显示shRNA-Bmi-1转染组胆囊癌细胞Bax及Caspase-3蛋白表达较对照组增加,而Bcl-2蛋白表达较对照组减少(p<0.05)。3.以抑癌基因WWOXmRNA为靶点的体外实验研究结果(1)WWOX基因真核表达载体的构建：pcDNA3.0-WWOX重组质粒经双酶切鉴定及基因测序证明所获得的WWOX基因扩增序列正确。(2)pcDNA3.0-WWOX重组质粒对胆囊癌细胞增殖、凋亡及细胞周期影响结果：RT-PCR及Westernblot检测显示pcDNA3.0-WWOX转染48小时后WWOXmRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组(p<0.05)；对照组间mRNA及蛋白表达量无显著差异(p>0.05)。免疫荧光检测结果显示pcDNA3.0-WWOX组细胞WWOX蛋白荧光强度在细胞核周围明显强于各对照组,而对照组间细胞WWOX蛋白荧光强度变化不明显。倒置显微镜观察发现pcDNA3.0-WWOX组贴壁的GBC-SD细胞数量明显减少,悬浮细胞及细胞碎片增加,而对照组细胞呈正常增殖状态,贴壁生长良好。MTT法检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性明显降低,且随时间推移细胞增殖抑制效果更为显著,对照组细胞增殖抑制不明显(P<0.05)。BrdU检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖率较对照组降低(P<0.05)。AnnexinV/7-AAD双染检测发现pcDNA3.0-WWOX组胆囊癌细胞早、晚期凋亡率较对照组增高(p<0.05)；而对照组间早、晚期凋亡率未见显著差异(P>0.05)。TUNNEL法检测显示转染pcDNA3.0-WWOX重组质粒24h/48h/72h后,胆囊癌细胞凋亡比率较对照组增加,以转染48h后更为明显(p<0.05)。细胞周期检测发现pcDNA3.0-WWOX组G0/G1期细胞增多,G2/M和S期细胞减少,细胞凋亡率增高,增殖指数降低(p<0.05)；而对照组间未见显著性差异(p>0.05)。JC-1染色检测细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)显示过表达WWOX基因胆囊癌细胞线粒体内绿色荧光信号显著高于空载体、脂质体及空白对照组,提示WWOX诱导胆囊癌细胞早期凋亡为主(p<0.05)。透射电镜观察pcDNA3.0-WWOX组细胞典型的凋亡形态学改变,出现核固缩、碎裂形成凋亡小体。(3)pcDNA-WWOX重组质粒对WWOX通路关键基因的影响结果：通过Real-timePCR,WesternBlot及免疫荧光染色检测显示特异性上调WWOX表达,胆囊癌细胞中P73、PUMA在转录及翻译水平的表达量均较对照组增加(p<0.05)；流式细胞仪检测发现特异性上调WWOX表达,胆囊癌细胞中Bax蛋白表达水平较对照组明显增加,而Bcl-2蛋白表达水平较对照组减少(p<0.05)。4.移植瘤体内试验研究结果裸鼠皮下接种GBC-SD细胞株5-7天后成瘤率为100%。shRNA-Bmi-1组移植瘤生长速度较对照组减慢,治疗6周实验终止时各实验组体积较治疗前增大,但shRNA-Bmi-1组移植瘤体积明显小于各对照组(shRNA-Scramble组、Lipofectamine组、GBC-SD组),其瘤体抑制率为60.6%(p<0.05),对照组间体积无明显差异(P>0.05)。HE染色显示shRNA-Bmi-1组细胞坏死明显,细胞形态模糊,见炎性细胞浸润,组织结构不清晰,而各对照组细胞异型性明显,炎性细胞较少,组织结构清晰。MaxVision染色发现shRNA-Bmi-1组移植瘤组织中Ki67及VEGF蛋白表达较对照组减弱,提示shRNA-Bmi-1组肿瘤新生血管生成减少、细胞增殖抑制明显。TUNEL及透射电镜检测显示靶向shRNA抑制Bmi-1体内可诱导胆囊癌细胞凋亡,与体外实验相符合。通过Real-timePCR、WesternBlot及免疫组织化学检测发现靶向shRNA干扰Bmi-1表达可特异性促进Bmi-1mRNA的降解及抑制其蛋白的表达,同时促进下游通路中关键基因WWOX/P73/PUMA/Bax表达,抑制Bcl-2的表达水平。[研究结论]1.Bmi-1、WWOX及PUMA的表达参与胆囊癌的发生发展过程,Bmi-1阳性表达率越高,或WWOX、PUMA阳性表达越低或表达缺失,提示肿瘤恶性程度增加、转移增快,Bmi-1、WWOX及PUMA的表达差异可能参与肿瘤的侵袭及演进。应用免疫组化联合检测胆囊癌组织中的Bmi-1、WWOX及PUMA的表达将有利于协助胆囊癌的早期诊断,有助于对其预后进行合理评估。2.体外成功构建了shRNA-Bmi-1重组载体。靶向沉默Bmi-1表达能有效促进胆囊癌细胞Bmi-1mRNA降解及抑制其蛋白表达,能特异性抑制胆囊癌细胞增殖,诱导其凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期,从而引起细胞DNA合成受阻,研究提示Bmi-1参与调控胆囊癌细胞的增殖和凋亡,维持细胞周期的运行,是抑制细胞凋亡和促进细胞异常增殖的重要因素。同时靶向沉默Bmi-1表达能有效促进WWOX通路中的关键基因WWOX/P73/PUMA/Bax/Caspase-3的表达,抑制Bcl-2蛋白表达,其作用可能与调控胆囊癌细胞生长效应的机制相关,Bmi-1及其Bmi-1/WWOX通路参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长。3.体外成功构建了pcDNA3.0-WWOX真核表达载体。过表达WWOX可有效抑制胆囊癌细胞WWOXmRNA降解、促进其蛋白表达,能有效抑制胆囊癌细胞的增殖活性、诱导其凋亡,使细胞周期阻滞于G0/G1期。同时上调并促进P73蛋白在胆囊癌细胞质中螯合积累,促进PUMA、Bax及抑制Bcl-2的转录和翻译过程,其作用可能是调控胆囊癌细胞生长的重要机制之一。WWOX/P73/PUMA通路通过调控线粒体依赖的凋亡途径来调节胆囊癌细胞的增殖、凋亡及细胞周期的变化,进一步证实了WWOX通路调控胆囊癌细胞的分子机制。4.成功建立胆囊癌裸鼠皮下移植瘤动物模型。靶向沉默Bmi-1表达能诱导胆囊癌移植瘤细胞凋亡,显著抑制肿瘤的生长及新生血管的形成,影响裸鼠皮下移植瘤Bmi-1/WWOX/P73/PUMA/Bax/Bcl-2通路关键基因的表达,与体外实验相符合。体内实验进一步验证了Bmi-1/WWOX通路参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长。5.Bmi-1及WWOX可能为胆囊癌基因靶向治疗提供潜在的分子靶标,通过靶向沉默Bmi-1表达和特异性性上调WWOX的表达可能是胆囊癌联合基因治疗的潜在治疗手段之一,阻断Bmi-1/WWOX通路对胆囊癌靶向性治疗策略具有重要意义,同时也为探索胆囊癌早期诊断及多分子联合靶向治疗提供了新的实验依据。
【作者】魏东；
【导师】张小文；
【作者基本信息】昆明医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】原发性胆囊癌；Bmi-1wwox；增殖；凋亡；细胞周期；信号通路；

【参考文献】
[1]刘婧.视频终端作业者干眼症情况调查[D].大连医科大学,眼科学,2012,硕士.
[2]黄珊珊.东京大都市区和北京轨道交通网络的拓扑结构对比及分析[D].北京交通大学,2015.
[3]刘佳.太仓市武术健身发展现状调查研究[D].苏州大学,体育教育训练学（专业学位）,2013,硕士.
[4]陈畅.从读者角度反思《火鸟》第一章翻译中的归化与异化[D].东北师范大学,翻译,2012,硕士.
[5]纪学武,彭忻,臧殿光,张延庆,聂刚,徐宝亮,黄川丽.多属性微断裂解释技术[J].石油地球物理勘探,2011,S1:117-120+163+172-173.
[6]江韬,初学导.基于规范形随机VDE新息表示和新息修正算法的多变量动态系统辨识方法[J].自动化学报,1990,01:31-39.
[7]法洪亮.员工组织公正感对离职倾向的影响研究[D].哈尔滨工业大学,技术经济及管理,2014,硕士.
[8]柳峰.MnAs_(1-x)P_x磁制冷材料的磁热效应研究[D].沈阳理工大学,物理电子学,2013,硕士.
[9]赖晓琴.注意规律在农村重点高中文科化学教学中运用的实验研究[D].湖南师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[10]王雅婷.BY房地产公司营销策略研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[11]郝娜.片材挤出机的形象识别设计研究[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[12]张永俊.基于SVM的增量入侵检测方法研究[D].西安科技大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[13]韩美荣.喀斯特峰丛洼地典型生态系统植被与土壤协同演变规律研究[D].江西农业大学,生态学,2012,硕士.
[14]崔伟胜.10KW光伏并网逆变器关键技术研究[D].北京交通大学,2014.
[15]龙伊人.高级阶段对外汉语教材中现当代文学作品的选编研究[D].湖南师范大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[16]李雅芳.PET-PA6嵌段共聚物结构表征[D].北京服装学院,纺织化学与染整工程,2012,硕士.
[17]刘博.柔性压电振子水下俘能特性研究[D].哈尔滨工业大学,机械电子工程,2014,硕士.
[18]吴海若.融合车载扫描和航空影像数据的建筑物三维建模[D].首都师范大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[19]李鑫.勃拉姆斯的“发展变异”原则[D].中央音乐学院,西方音乐史,2012,硕士.
[20]廖娟.安陆市土地流转现状、问题和对策研究[D].华中师范大学,农村与区域发展,2014,硕士.
[21]张学旺.基于数据挖掘技术的入侵检测研究[D].中南林学院,2003.
[22]王圣.基于神经网络的水文预报方法研究[D].华中科技大学,水利水电工程,2013,硕士.
[23]李欣然,郭希铮,王德伟,郝瑞祥,游小杰.基于LCL滤波的大功率三相电压型PWM整流器[J].电工技术学报,2011,08:79-84.
[24]陈军,石晓祥,杨红波,阮雪榆.知识挖掘方法在板料冲压工艺设计中的应用[J].上海交通大学学报,2003,05:695-698.
[25]赵文姬.云南仓储烟叶霉变及其生物防治研究[D].中国农业科学院,植物病理学,2004,硕士.
[26]张瑶.赭磁安神胶囊的药学及药效学研究[D].黑龙江中医药大学,方剂学,2013,硕士.
[27]王磊.中国金融发展与经济增长的非线性及非对称性关系研究[D].东北师范大学,数量经济学,2012,硕士.
[28]刘立夫.一种求反射界面倾向的方法[J].石油地球物理勘探,1978,01:27-31.
[29]李献民,梁艳慧,王梦恕.高速铁路过渡段动态响应试验与仿真对比分析[J].铁道工程学报,2014,03:39-45+81.
[30]刘晓丽.蔬菜物流环节嵌入质量追溯系统的成本与效益分析[D].南京农业大学,物流工程,2012,硕士.
[31]项忠彪.基于顾客满意度的创新产品动态管理机制研究[D].浙江大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[32]佟西伟.小型反渗透纯水机设计及效率分析[D].北方工业大学,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[33]郑霄龙.低品位热驱动跨临界CO2-[emim][Tf2N]吸收式制冷循环特性理论研究[D].内蒙古科技大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2014,硕士.
[34]王锡淮,李少远,席裕庚.基于自适应模糊聚类的神经网络软测量建模方法[J].控制与决策,2004,08:951-953.
[35]陈易.专利侵权判定中对等同原则的适用及其限制[D].华东政法大学,知识产权,2012,硕士.
[36]袁征.新形势下地方台民生新闻现象探析[D].扬州大学,教育技术学,2012,硕士.
[37]贾琳.雷达辐射源识别方法研究与实现[D].北京理工大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[38]郭娜.肝细胞生长因子对肺动脉高压作用机制的初步研究[D].中国人民解放军医学院,老年医学呼吸内科,2013,硕士.
[39]刘雪梅１,２,　邓子辰１,　胡伟鹏１.不可压饱和多孔弹性杆动力响应的多辛方法[J].应用数学和力学,2015,03:.
[40]黄颖峰.房地产项目风险管理研究[D].西南交通大学,项目管理,2013,硕士.
[41]刘荣萍.柑桔抗Alternaria alternata遗传分析及QTL定位[D].西南大学,微生物学,2014,硕士.
[42]平措旺拉.后藏婚礼祝赞词研究[D].西藏大学,藏语言文学,2014,硕士.
[43]任宪文.论破产法中劳动债权的优先清偿[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[44]黄颖.微生物发酵法降解大豆致敏原的研究[D].江南大学,营养与食品卫生学,2012,硕士.
[45]鲍捷.我国体育纠纷救济渠道多元化的研究[D].西安体育学院,体育人文社会,2013,硕士.
[46]陈悉妮.台州方言中的渔喻词汇研究[D].华东师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[47]金焕文.浙江B火电企业低成本运营战略研究[D].宁波大学,工商管理硕士,2013,硕士.
[48]顾九春,石建军,于泉.基于XML的开放式交通控制系统数据共享的结构探讨[J].交通与计算机,2004,06:37-40.
[49]陈长华.中国大陆户外音乐节发展现状研究[D].山东大学,艺术学,2013,硕士.
[50]尚斌.抑制自噬对内皮祖细胞促进静脉血栓机化再通的影响的实验研究[D].苏州大学,外科学,2013,硕士.