内脏脂肪素对氧化应激HUVECs的作用及其分子机制研究

【摘要】目的1.建立稳定有效的脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外培养方法,比较原代人脐静脉内皮细胞与人脐静脉内皮细胞株HUVEC-CS及EA.hy926的VWF、CD31、CD34表面抗原表达情况。2.采用过氧化氢(H202)体外诱导培养法,构建HUVECs氧化应激模型。观察体外正常培养HUVECsVisfatin的表达及氧化应激损伤对其表达的影响。3.观察Visfatin对体外正常培养及氧化应激损伤HUVECs的凋亡及多种细胞因子表达的影响,探讨其发挥效应的可能信号通路。4.探讨血浆Visfatin的影响因素及其与冠心病、糖代谢异常的相关性。应用eZscan系统和实验室方法对冠心病患者进行糖代谢异常的筛查,探讨eZscan系统的临床应用价值和前景。方法1.用0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离原代人HUVECs,加入含内皮细胞生长因子的M199完全培养基内培养,]HUVEC-CS及EA.hy926细胞株用DMEM完全培养基培养。0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化传代,三种细胞在倒置相差显微镜下观察形态学,免疫荧光染色法测定VWF表达,流式细胞仪检测CD31、CD34表面抗原表达。2.①体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,将实验细胞分为对照组、模型组,在剂量效应干预中,模型组分为6个不同浓度梯度(H202终浓度分别为100、200、400、600、800、1OOOμmol/L),筛选H202最佳作用浓度；在时间效应干预中,以筛选出的H202最佳作用浓度分别培养细胞6、12、24h,筛选最佳作用时间。收集各组细胞进行相关检测：倒置显微镜及透射电镜观察细胞形态学变化；采用细胞计数试剂盒(CCK-8法)检测细胞存活率；DCFH-DA荧光探针和流式细胞技术(FCM)检测细胞内活性氧水平；流式细胞技术TUNEL法检测细胞凋亡率和增殖指数。②体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,将实验细胞随机分为正常对照组和H202处理组(H202终浓度分别为50、100、200、400、1000μmol/L),培养1、2、4、24h分别进行检测。Vesternblot检测visfatin蛋白水平的变化,RealtimePCR测定Vistafin基因表达。3.体外培养的人脐静脉内皮细胞株传代后进行实验,将实验细胞随机分组后予Visfatin、SB203580、LY29004相应干预处理,流式细胞仪TUNEL法检测细胞凋亡率和细胞周期,ELISA定量检测IL-6、MCP-1、VCAM、VEGF、iNOS浓度。4.选取160例冠心病患者,根据患者是否合并糖代谢异常,将其分为冠心病合并糖代谢异常组及单纯性冠心病组；同期选择无器质性心脏病的糖代谢异常患者50例；同期选取50例健康人群作为正常对照组。空腹测定所有受试者实验室指标及血浆Visfatin水平,并进行baPWV及ABI检测,应用eZscan系统(糖尿病及并发症风险早期检测系统)对经冠脉造影确诊的冠心病患者进行糖代谢异常筛查,并将检测结果与实验室检查结果进行比较,评价其灵敏度和特异度。结果1.①原代HUVECs在接种24h后完全贴壁生长,呈多角形,单个或成团存在,4-5天后融合呈铺路石样镶嵌排列。HUVEC-CS和EA.hy926细胞为圆形或扁平形,生长速度快,2天左右即可铺满,融合后呈典型的“鹅卵石”状排列。②原代HUVECs及EA.hy926细胞的VWF免疫荧光染色呈阳性反应,大部分细胞内可见绿色荧光,HUVEC-CS细胞则染色呈阴性。HUVEC-CS细胞CD31阳性表达率(%)(4.70±0.46)显著低于原代HUVECs(77.93±0.25)或EA.hy926细胞(78.23±0.40),差异均有统计学意义(P均<0.001),原代HUVECs和EA.hy926细胞间无统计学差异(P>0.05)。原代HUVECsCD34阳性表达率(%)(43.1±0.20)显著高于HUVEC-CS细胞(1.20±0.40)或EA.hy926细胞(0.97±0.40),差异均有统计学意义(P均<0.001),HUVEC-CS和EA.hy926细胞间无统计学差异(P>0.05)。2.①与正常组比较,H202模型组HUVECs细胞形态学明显改变,细胞体积缩小,胞膜皱缩,细胞轮廓不清,形状不规则,细胞排列紊乱,部分细胞上浮,典型单层铺路石样细胞排列受到不同程度的破坏。梭型细胞减少,出现球形或椭圆形细胞,球形或椭圆形细胞数量随作用时间延长和剂量增加而增多,表明H202对HUVECs具有损伤作用。CCK-8显示随着H202作用浓度的增加和时间的延长,HUVECs存活率逐渐下降,呈现一定的量效和时效关系。DCFH-DA荧光探针和流式细胞技术(FCM)检测H202模型组细胞内有较高的活性氧水平。流式细胞技术TUNEL法观察证实H202能够诱导HUVECs发生凋亡,随着H202作用浓度的增加细胞凋亡率明显增加。②体外正常培养的HUVECs表达Visfatin。予不同浓度H202(50、100、200、400、1000μmol/L)作用HUVECs不同时间(1、2、4、24h),结果发现,在低浓度H202(50、100μmol/L)作用时,Visfatin的表达随H202作用时间延长而增加(P<0.05),但H202浓度≥200μmol/L时,Visfatin的表达随H202作用时间延长而减少；在H202短时间(1、2h)作用时,Visfatin的表达随H202作用浓度增加而增加(P<0.05),但H202作用时间延长后(≥4h),随H202作用浓度增加Visfatin的表达减少(P<0.05)。由、Vesternblot蛋白印迹灰度分析及RealtimePCR检测VisfatinmRNA表达量得出的变化趋势是一致的。3.对体外正常培养的HUVECs,Visfatin100ng/ml、400ng/ml、800ng/m1培养细胞24h/48h细胞凋亡率及细胞增殖指数与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)。不同浓度Visfatin处理正常培养细胞24h/48h后,IL-6,MCP-1,VCAM,VEGF,iNOS表达较正常对照组均增加(P均<0.05),且与Visfatin呈浓度和时间依赖性。对氧化应激损伤的HUVECs,Visfatin100ng/ml、400ng/ml、800ng/ml预处理细胞24h/48h的细胞凋亡率较H202对照组明显下降(P<0.001),但3种浓度Visfatin处理组间两两比较,随着Visfatin浓度递增,细胞凋亡率反而逐渐增加,任意两组间均有统计学差异(P<0.05)。Visfatin预处理细胞24h后,氧化应激损伤HUVECs的增殖指数较H202对照组上升,差异有统计学意义(P<0.001)。经两两比较,Visfatin浓度由100ng/ml增加至400ng/ml或800ng/ml时,细胞增殖指数逐渐下降,差异有统计学意义(P<0.05),Visfatin400ng/ml预处理组与Visfatin800ng/ml预处理组间无统计学差异(P>0.05)。Visfatin100ng/ml、400ng/ml、800ng/ml预处理细胞48h不同处理组的细胞增殖指数较H202对照组上升,差异有统计学意义(P<0.001)。经两两比较,随着Visfatin浓度增加,增殖指数逐渐降低,当Visfatin浓度为800ng/ml时,细胞增殖指数较对照组下降,差异有统计学意义(P<0.01)。Visfatin预处理细胞24h后,IL-6,MCP-1,VCAM,VEGF,iNOS五个细胞因子表达增加,不同处理组间有统计学差异(P<0.05),并经两两比较,除了VCAMVisfatin100ng/ml组与H202对照组间差异无统计学意义外(P>0.05),各细胞因子表达随Visfatin浓度升高而增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。Visfatin预处理细胞48h后,IL-6,MCP-1,VCAM,VEGF,iNOS五个细胞因子表达增加,不同处理组间有统计学差异(P<0.05),经两两比较,各细胞因子表达随Visfatn浓度升高而增加,任意两组间差异均有统计学意义(P<0.05)。p38MAPK抑制剂SB203580及PI3K抑制剂LY29004预处理后,可以部分阻断Visfatin抗细胞凋亡、促细胞增殖、促炎症因子表达的效应,各组间细胞凋亡率、细胞增殖指数、细胞因子IL-6、MCP-1、VCAM、iNOS水平的差异有统计学意义(P<均0.05),除MCP-1外,这2种不同的通路抑制剂的作用差异具有统计学意义,p38MAPK抑制剂的作用更为显著(P<0.05)。4.血浆Visfatin水平从高到低依次为冠心病组、糖代谢异常组、正常对照组(P<0.05)。冠心病不同临床类型(慢性稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛、急性心肌梗死)血浆Visfatin水平递增性升高(P<0.05),冠心病合并糖代谢异常患者Visfatin显著高于未合并糖代谢异常冠心病患者(P<0.05)。Visfatin水平与BMI、SBP、TC、LDL-C、FPG、Fins、HOMA-IR正相关(P均<0.05),BMI、HOMA-IR对血浆Visfatin水平的影响尤为显著(P均<0.05)。eZscan系统筛查糖代谢异常的敏感度88.89%,特异度64.95%。受试者工作特征曲线表征EZSCAN筛查糖代谢异常的准确性有意义(曲线下面积0.769,P=0.000)。baPWV测值随冠脉狭窄程度有递增趋势,ABI测值则与冠脉狭窄程度负相关(P均<0.05)。结论1.人脐静脉灌注Ⅱ型胶原酶消化、加入含内皮生长因子的M199完全培养基培养,可获得高纯度、可传代的存活内皮细胞,改进消化培养方法能提高细胞数量,其表面抗原表达优于HUVEC-CS和EA.hy926细胞株,但细胞产出量不高,传代5-6次后细胞形态变化较大,在复杂基础研究中应用受限。EA.hy926永生细胞株培养方法简单,成活率高,生长迅速,细胞形态稳定,其表型与原代HUVECs相似度高,短时间内可获得足够数量细胞满足相关实验研究。两者均是组织工程及相关医学基础研究理想的细胞来源。2.①用含800gmol/L过氧化氢的培养基培养24h可成功建立HUVECs氧化应激模型。②体外正常培养的HUVECs表达Visfatin,H2O2促进Visfatin表达增加有量效和时效性,短时间内或低浓度作用能促进Visfatin的表达,而浓度增高或时间延长,反而抑制Visfatin的表达。3.①对体外正常培养的HUVECs,Visfatin100ng/ml、400ng/m;、800ng/ml培养细胞24h/48h未对细胞的凋亡及增殖未造成明显影响。Visfatin呈浓度及时间依赖性促进体外正常培养的HUVECs表达IL-6、MCP-1、CAM、VEGF、iNOS。②对氧化应激损伤HUVECs,Visfatin100ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培养细胞24h/48h细胞凋亡率较H202对照组明显下降、增殖指数上升,但Visfatin抗内皮细胞凋亡促增殖效应不随着浓度增加时间延长而递增。Visfatin呈浓度及时间依赖性引起氧化应激损伤HUVECs的IL-6、MCP-1、VCAM、VEGF、iNOS表达显著增加。③予p38MAPK抑制剂SB203580及P13K抑制剂LY29004预处理后,可以部分阻断visfatin抗细胞凋亡、促细胞增殖、促炎性细胞因子表达的效应,提示visfatin抗细胞凋亡、促细胞增殖、促炎性细胞因子表达的效应可能与p38MAPK信号通路及见P13K信号通路有关,其中以P38MAPK信号通路的作用更为显著。4.BMI、HOMA-IR对血浆Visfatin水平的影响有统计学意义。Visfatin可能在糖代谢异常、AS的发生发展过程中起到了一定作用。应用eZscan系统进行糖代谢异常的早期筛查简单省时、无创安全、不受空腹限制,具有较高的灵敏度和中等特异度。baPWV及ABI检测无创、简单、价廉、重复性好,对及早发现冠心病高危患者和评估冠脉病变的严重程度发挥着一定的作用。
【作者】戴青原；
【导师】郭涛；
【作者基本信息】昆明医科大学，外科学，2014，博士
【关键词】脐静脉内皮细胞；氧化应激；内脏脂肪素；冠心病；糖代谢异常；

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