血管平滑肌细胞DGCR8及卵巢癌细胞KLF4基因功能研究

【摘要】近年来心血管疾病以及卵巢癌发病率大幅度提高,成为严重威胁人类健康特别是女性健康的主要疾病。目前一些心管疾病的介入治疗和药物治疗的疗效并不理想,其发病机制尚未完全被阐明。根据分子生物学的观点,某些基因的异常表达是其发病的根本原因。现已有很多报道显示miRNA与心血管系统和心血管疾病的发生发展密切相关,但与miRNA合成有关的DiGeorge综合征危象区基因8(DiGeorgesyndromecriticalregiongene8,DGCR8)在血管中的功能还未有报道。此外,对癌基因、抑癌基因异常表达的研究,成为当前肿瘤生物学领域的热门课题,而卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最为严重的疾病之一,目前虽已有很多卵巢癌抑癌基因的相关报道,但KLF4在卵巢癌中的确切功能尚不知晓。本论文第一部分针对DGCR8在血管平滑肌细胞中的功能及其作用机制展开了研究。DGCR8是位于人类22号染色体q11.2区域的一个等位基因,是双链miRNA结合蛋白,它与RNA酶ⅢDrosha相互作用,促进miRNA的成熟。而迪乔治综合症(DGS)则是由第22对染色体突变所致。迪乔治综合症是一种伴随发育缺陷的先天性疾病,伴有先天性心脏病,包括主动脉弓中断,室间隔缺损以及永存动脉干等心血管畸形。因此我们推测DGCR8基因通过控制miRNA的生成从而影响心血管系统的发育。在此课题中,为了研究DGCR8在心血管中的确切功能及作用机制,我们利用Loxp/Cre重组酶系统,将SM22-CRE转基因小鼠与DGCR8Loxp/Loxp纯和小鼠杂交,构建血管平滑肌细胞条件性DGCR8基因敲除小鼠。首先我们将基因型分别为DGCR8Loxp/+/CRE与DGCR8Loxp/+的亲代小鼠杂交,用普通PCR的方法检测子代小鼠的基因型。在检测的78只子代小鼠中,未发现基因型DGCR8Loxp/Lox/CRE的小鼠,推测DGCR8基因敲除幼鼠胚胎期死亡,而观察到其他基因型的小鼠均能够存活且表现型正常。为进一步确定DGCR8基因敲除小鼠胚胎期死亡时间,我们分别解剖了孕期9.5-15.5天的亲代小鼠,并用PCR的方法检测各胚胎鼠的基因型,发现DGCR8敲除鼠在胚胎期12.5至13.5天之间死亡,胚胎期14.5天后未检测到存活的DGCR8基因敲除小鼠。此外,我们发现胚胎期12.5天后的DGCR8基因敲除鼠出现肝脏出血且卵黄囊上的血管消失。在解剖过程中我们收集了正常小鼠以及DGCR8基因敲除鼠的胚胎,并用HE染色进行组织学分析,发现相比正常小鼠DGCR8基因敲除鼠的血管腔变大,管壁变薄,且其心脏腔室变大,室壁变薄,与临床晚期心力衰竭症状相似。且相较正常鼠而言DGCR8基因敲除鼠的肝脏、心脏变大,肺脏和胃则变小。为了进一步探究DGCR8基因敲除鼠表现型异常的原因,我们分别从细胞增殖,分化,凋亡几方面进行了体内体外研究。首先我们利用WesternBlot以及免疫荧光染色(t=6.395,t=4.638,P<0.01)的方法对PCNA的表达进行了分析,发现DGCR8的缺失使PCNA的表达量显著降低。同时我们还检测了对照组及DGCR8基因敲除的血管平滑肌细胞在不同时间点的细胞增殖率,结果显示DGCR8基因敲除VSMCs与对照组VSMCs增殖速率间的差异有统计学意义,DGCR8基因敲除的血管平滑肌细胞的增殖速率显著下降(t=3.289,t=6.994,t=8.099,t=5.061,P<0.01,P<0.001).其次,我们在体内用TUNELStaining的方法检测了正常鼠及敲除鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的凋亡(t=-3.501,P<0.05),并在体外用AnnexinVStaining及WesternBlot的方法测定正常及DGCR8基因敲除的小鼠血管平滑肌细胞的凋亡情况(t=-12.947,P<0.01),发现DGCR8的敲除加速了血管平滑肌细胞的凋亡。由于分化标志基因(αSMA、SM22、CNN1)调节着血管平滑肌细胞的收缩功能,因此我们用抗aSMA的抗体对E12.5天的正常及DGCR8基因敲除的胚胎小鼠胸主动脉(t=-3.783,P<0.01)以及血管平滑肌细胞(t=3.350,P<0.05)进行了免疫荧光染色并用WesternBlot的方法检测了体内外血管平滑肌细胞的标志基因,发现aSMA,SM22及CNN1的表达在DGCR8基因敲除的血管平滑肌细胞中均显著降低。为了进一步检测DGCR8基因的缺失是否会降低血管平滑肌细胞的收缩能力,我们进行了胶原凝胶收缩实验检测了对照组以及DGCR8基因敲除的血管平滑肌细胞的收缩能力,结果显示,对照组及DGCR8基因敲除血管平滑肌细胞之间的差异具有统计学意义,DGCR8基因的缺失使血管平滑肌细胞的收缩能力显著下降(t=6.399,P<0.01)。由于DGCR8与miRNA的生物合成密切相关,为了进一步探究DGCR8在血管平滑肌细胞中的作用机制,我们提取了正常鼠及DGCR8基因敲除鼠的脐动脉RNA进行miRNAarray*检测了670种miRNA的表达。在可检测到的218种miRNAs中,相较于正常鼠DGCR8基因敲除鼠的血管平滑肌细胞中有171种miRNAs表达明显下降,31种miRNAs表达明显上升,16种miRNAs没有显著变化。并观察到miR-17/92及miR-143/145在DGCR8基因敲除的血管平滑肌细胞中下降最为明显。之前有文章报道miR-143/145调节着血管平滑肌细胞分化与增殖之间的转化,为了证实miR-145在血管平滑肌细胞中的作用,我们用空白及高表达miR-145的慢病毒体外转染血管平滑肌细胞,表达48h后,将转染后的细胞进行免疫荧光染色检测aSMA的表达,发现随着miR-145的表达升高aSMA的表达也随之升高(t=3.115,P<0.05),这一结果证实了之前的报道。而miR-17/92在血管平滑肌细胞中的功能还未有报道。为了探究miR-17/92是否是引起DGCR8基因敲除小鼠表现型缺陷的原因,我们用高表达miR-17/92的慢病毒感染血管平滑肌细胞,进而分别测定细胞的增殖,分化能力。WesternBlot、PCNA免疫荧光染色(t=-5.682,<0.01)以及细胞生长曲线结果(t=-6.254,t=-8.213,t=-6.791,t=-7.895,P<0.01)均显示miR-17/92高表达的细胞相较正常细胞增殖能力显著增强。此外,我们将对照组及miR-17/92高表达的血管平滑肌细胞进行24小时饥饿处理,而后分别用PDGF和FGF2处理细胞,细胞生长曲线显示miR-17/92增强了PDGF和FGF2诱导的细胞增殖。同时我们检测了血管平滑肌细胞分化标志基因(aSMA、SM22、CNN1),发现miR-17/92高表达的细胞中aSMA及SM22表达显著升高,而CNNl的表达没有明显变化。我们进一步对两条生存信号转导通路ERK1/2及AKT进行了检测,发现miR-17/92的升高激活了两条通路,P-ERK以及P-AKT的表达在miR-17/92高表达的细胞中显著升高。而先前报道称miRNA的生物合成与TGFB信号转导通路存在交叉反应,且受到ERK1/2的调控。因此我们检测了正常及DGCR8基因敲除鼠的脐动脉及体外小鼠血管平滑肌细胞中P-ERK以及P-AKT的表达,证实了DGCR8的缺失导致了两条生存信号转导通路的减弱。以上结果均采用SPSS13.0统计软件进行处理,计量资料用均数±标准差(X±s)表示,多因素的计量资料采用析因设计的方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。miRNA以及mRNA的检测则采用两独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。基于以上结果,我们得出结论DGCR8基因的缺失导致了miR-17/92及miR-143/145表达的显著下降,从而降低了血管平滑肌细胞的增殖、分化能力,同时抑制了ERK1/2及AKT两条生存信号转导通路,导致DGCR8基因敲除小鼠出现心血管相关临床病理症状,最终导致小鼠胚胎期死亡。本论文第二部分针对KrUppel样因子4(KLF4)在卵巢癌细胞中的功能及其作用机制展开了研究。卵巢癌是导致高死亡率的妇科癌症之一,尽管近年来其发生率和死亡率都有所改善,但每年仍有超过20000个的新增病例被诊断出。且由于卵巢癌的抗药性及频繁复发的特性,使卵巢癌的治疗受到了很大局限。而KLF4是一个在多种组织细胞中均广泛表达的锌指样结构转录因子,参与细胞的增殖和分化。目前KLF4的功能在不同种类的癌症中已有广泛研究,且在不同癌症中所表现的功能也不尽一样,如在前列腺癌、结肠癌中,KLF4作为癌基因,而在肺癌、宫颈癌中,便是抑癌基因。而KLF4在卵巢癌中的作用尚未有报道。在此课题中,为了研究KLF4在卵巢癌细胞中的功能及作用机制,我们分别构建了强力霉素依赖的可诱导型GFP和KLF4慢病毒表达载体,并用包装的病毒感染SKOV3及OVCAR3卵巢癌细胞,形成可诱导表达的稳定细胞系,GFP转染细胞系作为对照组细胞。为了验证此系统的效率,我们在不同的时间点将同等量的强力霉素加入SKOV3细胞中诱导GFP及KLF4的表达,WesternBlot的结果显示GFP及KLF4的表达水平随着时间的推移逐渐增加。同时,我们观察到在诱导48小时后,KLF4高表达的SKOV3细胞相较于对照组细胞形态上发生了上皮样改变,而OVCAR3形态未有变化。为了探究KLF4引起卵巢癌细胞发生改变的原因,我们分别从细胞增殖、迁移、浸润能力几个方面进行了研究。首先采用MTT实验检测了卵巢癌细胞的增殖能力,发现SKOV3细胞诱导表达KLF4后,MTT吸光度OD570值明显下降,表明KLF4的高表达抑制了卵巢癌细胞的增殖(F=25.107,F=15.650,F=15.135,F=34.643,P<0.01,P<0.001)。此外在SKOV3细胞中分别进行了细胞集落形成实验(F=386.321,P<0.001)以及软琼脂集落形成实验(F=150.769,P<0.001),发现高表达KLF4的细胞相对于其他对照组形成的集落数明显下降。为了进一步验证KLF4的细胞增殖抑制作用,我们采用另一卵巢癌细胞OVCAR3进行了细胞集落形成实验,结果显示高表达KLF4的OVCAR3细胞的集落形成数相较于其他对照组显著下降(F=182.616,P<0.001)。此外采用细胞划痕实验以及滤孔迁移分析实验检测了KLF4对于卵巢癌细胞的分化能力的影响,结果显示高表达KLF4的细胞迁移能力明显受到抑制。在细胞划痕24小时后,高表达KLF4的SKOV3细胞迁移距离显著小于其他对照组细胞(F=13.608,P<0.01)。在滤孔迁移分析实验中,高表达KLF4后的SKOV3以及OVCAR3细胞迁移数明显低于其他对照组细胞(F=174.615,F=86.81,P<0.001)。同时我们进行了细胞侵袭实验来检测KLF4对卵巢癌细胞浸润能力的影响,发现KLF4的表达升高抑制了卵巢癌细胞SKOV3及OVCAR3的浸润能力(F=246.022,F=65.025,P<0.001)。基于以上结果,KLF4的表达抑制了卵巢癌细胞的增殖、迁移和浸润能力,在卵巢癌细胞中起到了抑癌基因的作用。而有报道称,KLF4可以通过促进间叶上皮细胞转化引起干细胞的重新编程,且在肝癌、乳腺癌以及前列腺癌中通过抑制上皮间叶细胞转化起到抑制癌细胞的作用。为了探究KLF4在卵巢癌细胞中是否也通过抑制上皮间叶细胞转化起到抑制癌细胞的作用,采用WesternBlot检测对照组细胞及KLF4高表达细胞中间叶细胞标志基因Snail2和Vimentin以及上皮细胞标志基因E-cadherin的表达。结果显示KLF4高表达的SKOV3及OVCAR3细胞相较其他对照组细胞E-cadherin表达显著升高,而Snail2和Vimentin表达则显著降低。为了验证此结果采用免疫荧光染色方法对SKOV3对照组及KLF4高表达组细胞进行E-cadherin、Snail2和Vimentin染色,结果与WesternBlot实验一致。为了进一步探究E-cadherin的表达上调是否与其转录激活有关,我们收集了KLF4转染的SKOV3诱导表达和未诱导表达的细胞进行染色质免疫共沉淀反应(CHIP),并用荧光定量PCR方法检测纯化后富集的核染色体内E-cadherin启动子片段的含量。结果显示,KLF4高表达的SKOV3细胞与对照组细胞中E-cadherin表达量的差异具有统计学意义,其E-cadherin的表达量相较于对照组细胞提高了约15倍,提示KLF4在卵巢癌细胞中特异性结合E-cadherin的启动子,从而激活E-cadherin的表达(t=-10.505,P<0.01)。另外有研究发现TGFB在许多癌症中促进上皮间叶细胞的转化,因此我们用不同浓度的TGFB处理SKOV3及OVCAR3细胞,发现随着TGFB的升高,上皮细胞标志基因E-cadherin表达逐渐下降,间叶细胞标志基因Snail2和Vimentin表达逐渐上升,因此TGFβ可以诱导卵巢癌细胞上皮间叶细胞的转化。此外我们又进一步用不同浓度的TGFB处理了对照组和KLF4高表达的SKOV3及OVCAR3细胞,发现KLF4的高表达抑制了TGFB诱导的上皮间叶细胞转化。然而基于先前的报道,KLF4在乳腺癌细胞中的作用存在争议,为了确证KLF4在乳腺癌细胞中的作用,我们在高表达KLF4的MCF7细胞以及对照组MCF7细胞间进行了集落形成实验,发现KLF4的表达抑制了MCF7细胞集落的形成(F=70.438,P<0.001)。同时检测了对照组及KLF4高表达MCF7细胞中E-cadherin、Snail2及Vimentin的表达,发现KLF4的表达抑制了MCF7细胞中Snail2的表达,促进了E-cadherin的表达,vimentin未被检测到。因此KLF4在乳腺癌细胞中起到抑癌基因的作用,与卵巢癌细胞相似。以上结果均采用SPSS13.0统计软件进行处理,计量资料用均数±标准差(X±s)表示,若方差齐性采用ONE-WAYANOVA,多重比较采用LSD法;多因素的计量资料采用析因设计的方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义；miRNA以及mRNA的检测则采用两独立样本t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结论：KLF4通过抑制TGFβ诱导的上皮间叶细胞转化,抑制了卵巢癌细胞以及乳腺癌细胞的增殖、集落形成以及细胞的迁移浸润能力,起到对卵巢癌及乳腺癌的抑制作用。综上所述,本论文一方面初步阐明了DGCR8基因在血管平滑肌细胞中的功能及作用机制：DGCR8的缺失导致了miR-17/92及miR-145表达的显著下降,从而降低了血管平滑肌细胞的增殖、分化能力,同时抑制了ERKl/2及AKT两条生存信号转导通路。DGCR8在血管平滑肌细胞的发育过程中起到重要的作用。另一方面论文初步阐明了KLF4在卵巢癌细胞中的功能及其作用机制,KLF4通过抑制TGFβ诱导的上皮间叶细胞转化,抑制了卵巢癌细胞以及乳腺癌细胞的增殖、集落形成以及细胞的迁移浸润能力,起到对卵巢癌及乳腺癌的抑制作用。
【作者】陈姿喧；
【导师】黎诚耀；岳军明；
【作者基本信息】南方医科大学，免疫学，2014，博士
【关键词】DiGeorge；综合征危象区基因8；微小RNA；血管平滑肌细胞；人类Kruppel样因子4；间叶上皮细胞转化；卵巢癌细胞；

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