DPP4抑制剂西格列汀对动脉粥样硬化的影响及其机制探讨

【摘要】[背景]糖尿病(diabetesmellitus,DM)目前已在全球范围内流行,成为发展中国家和发达国家严重危害人类健康和生命的疾病,其主要危害在于慢性并发症的发生。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,糖尿病的发病率日益增加,糖尿病血管并发症的发生率也在逐渐增加,给患者带来了严重的经济和社会负担。糖尿病血管病变包括大血管病变和微血管病变。糖尿病大血管病变包括脑血管疾病、冠心病(coronaryheartdisease,CHD)和周围血管疾病；糖尿病微血管病变包括糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN),糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)和糖尿病周围神经病变(diabeticperipheralneuropathy,DPN)。糖尿病大血管并发症是导致2型糖尿病患者死亡的主要原因,而动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)则是其最主要的病理特征,动脉粥样硬化是一种常见的以慢性炎症反应为主要特征的血管疾病,主要累及大中型血管动脉内膜,血管内皮受损为其起始环节,继而引起血脂沉积,单核细胞聚集,泡沫细胞形成,平滑肌细胞增生和血管内皮细胞功能紊乱,最终导致动脉粥样硬化病变的形成。鉴于糖尿病大血管病变的发生率日益增加及其可能带来的严重危害,如何预防糖尿病大血管病变已经成为全球共同关注的重要问题,然而糖尿病大血管病变的发病机制至今仍不十分清楚,因此也给治疗方案的选择带来了一定的困难。二肽基肽酶-4(dipeptidylpeptidase-4,DPP-4)抑制剂是一种新型的口服降糖药物,主要是通过选择性抑制DPP-4的活性,阻止胰高血糖素样肽-1(glucagonlikepeptide-1,GLP-1)降解失活,增加血清中活性GLP-1的水平以及延长GLP-1的作用时间来增加其生理作用,从而发挥降低血糖的作用,DPP-4抑制剂除了可以降低糖基化血红蛋白(glycoseylatedhemoglobin,HbA1C),空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)和餐后血糖(postprandialbloodglucose,PBG)的水平之外,还能促进胰岛p细胞分泌胰岛素并抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素,从而改善胰岛细胞功能紊乱,并且不增加体重和低血糖等不良反应的发生率。GLP-1是由人胰高血糖素基因编码,小肠L细胞分泌的一种肽类激素,在食物中营养物质的刺激下分泌并释放入血液,从而发挥其生理作用。GLP-1以葡萄糖依赖方式作用于胰岛p细胞,促进胰岛素基因的转录,增加胰岛素的生物合成和分泌,同时刺激胰岛p细胞的增殖和分化,抑制p细胞凋亡,增加p细胞数量,改善p细胞功能,并抑制α细胞分泌胰高血糖素,从而发挥降低糖化血红蛋白、空腹血糖和餐后血糖的作用；此外GLP-1还可抑制食欲及摄食,延缓胃内容物排空以及降低体重。然而内源性GLP-1的半衰期很短,极易被体内的DPP-4降解而失活,DPP-4又称T细胞表面抗原CD26,是一种细胞表面的丝氨酸蛋白酶,部分以可溶形式存在于循环血液中,其主要酶活性作用是优先将氨基末端第2个氨基酸寡肽的氨基末端前两个氨基酸剪切去除,而天然GLP-1的氨基末端第二个氨基酸可被DPP-4剪切成为截断的GLP-1,失去促胰岛素分泌活性,该失活作用快速且不可逆。目前大量研究证实GLP-1受体激动剂可以延缓动脉粥样硬化的发生发展,作用机制可能与GLP-1类似物作用于GLP-1受体(glucagonlikepeptide-1receptor,GLP-1R)之后,激活环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cyclicadenosinemonophosphate/proteinkinaseA,cAMP/PKA)信号通路,与改善炎症反应和血管内皮功能等作用相关。而西格列汀作为一种竞争性DPP-4抑制剂,可与DPP-4高保守的p螺旋区谷氨酸盐残基非共价结合,抑制DPP-4的活性,通过增加生理性GLP-1的活性和作用时间从而发挥降糖作用,有研究报道显示它除了具有降低血糖的作用之外,还可能在心血管疾病方面存在保护作用。近年来有研究提示西格列汀可能延缓动脉粥样硬化的发展,但具体作用机制很复杂且目前尚不清楚。有些研究推断可能也是通过作用于GLP-1R后激活cAMP/PKA信号通路,发挥心血管保护作用有关；但也有些研究认为西格列汀可能通过增加一氧化氮等途径来起到保护血管内皮的作用,并不依赖于cAMP/PKA或者是PI3K/Akt信号通路。研究证实AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)信号通路都可能参与了动脉粥样硬化形成的机制调节过程。AMPK作为生物代谢能量调节的重要分子,表达于各种代谢相关的器官中,研究发现它的活化具有抗动脉粥样硬化的作用,主要通过上调Akt/eNOS信号通路,从而抑制p38介导的核因子κB(nuclearfactorκB,NF-κB)活化过程,继而减轻炎症反应；而MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,MAPK信号通路主要包括p38、细胞外信号调控的蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedkinasemediates,Erk)以及c-JunN端激酶(c-junamino-terminalkinase,JNK)／应激激活蛋白激酶(stress-activatedproteinkinase,SAPK)等途径,是细胞将信号从细胞外传递到细胞内的主要通路,研究证实其在抑制后可能通过抑制粘附分子的表达、抗炎症作用以及增加粥样斑块的稳定性,从而对动脉粥样硬化疾病起到保护作用。虽然目前关于糖尿病大血管并发症的发病机制仍不清楚,但多认为与以下五个方面有关,即蛋白激酶C(proteinkinseC,PKC)的活化、蛋白质非酶促糖基化、氧化应激、多元醇通路异常和己糖胺途径异常,其中慢性高血糖所诱导的血管组织PKC活化被认为是最重要的机制之一。PKC作为一种重要的蛋白激酶,广泛存在于人体各种组织和细胞中,属于丝氨酸／苏氨酸激酶家族成员,它不是单一分子的酶,而是一组相互之间密切相关、有多种亚型的蛋白质家族,可作用于多种信号转导通路,使细胞内多种蛋白质磷酸化,从而调控细胞生长、增殖、衰老、凋亡等一系列生理生化过程。目前已经发现PKC包括经典型、新型和非典型三大类,共11种亚型。经典型又称cPKC,包括PKCα、β(ⅠⅡ)和γ,可被钙离子、二脂酰甘油和佛波酯激活；新型又称nPKC,包括PKCδ、ε、η和θ,可被二脂酰甘油和佛波酯激活；非典型又称aPKC,包括PKCζ和λ,一般是被磷脂类物质所激活,其激活不依赖于钙离子、二脂酰甘油或佛波酯。PKC的分布具有亚型特异性,心血管组织中有多种PKC亚型表达如PKCα、PKCβ、PKCδ、PKCζ等,β亚型主要分布在心血管组织,故研究最多。多种因素可诱导PKC的活化,但高血糖是最重要的诱导因素,在糖尿病高血糖状态下,中间代谢产物糖基化终末产物(advancedglycationendproducts,AGEs)、活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)、细胞因子和生长因子等均可使二脂酰甘油的从头合成增加,进而激活PKC。既往研究提示PKCβ活化可能促进动脉粥样硬化的发生,但机制仍不清楚,且目前关于西格列汀与PKCβ之间可能存在的关系国内外尚无相关报道。针对本领域存在的上述问题,我们对本课题研究进行设计,首先以动脉粥样硬化的经典模型载脂蛋白E基因敲除(apolipoproteinEknockoutmice,ApoE-/-)小鼠作为研究对象,探讨新型降糖药物西格列汀是否具有独立于降糖作用之外的心血管保护作用以及可能存在的作用机制；同时将血管内皮细胞特异性PKCβ过表达转基因小鼠(vascularendothelial-specificPKCβover-expressiontransgenicmice,VEPKCβ+/-)与ApoE-/-小鼠进行杂交后,制备出血糖正常的以ApoE-/-为背景的PKCβ转基因动物模型(VEPKCβ+/-ApoE-/-)作为研究对象,观察血管内皮特异性PKCβ过表达对动脉粥样硬化病变的影响,并对该模型给予西格列汀干预,观察西格列汀是否可延缓该动物模型动脉粥样硬化的发生发展,同时探讨可能存在的作用机制,为西格列汀预防2型糖尿病大血管并发症的临床应用提供更多的理论依据。第一部分DPP-4抑制剂西格列汀对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化的影响及其机制研究[目的]1、观察DPP-4抑制剂西格列汀对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响。2、探讨西格列汀延缓动脉粥样硬化形成的机制是否与激活AMPK和抑制MAPK信号通路有关。[方法]1、将24只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠作为实验对象,分为两组,每组12只,分别给予高脂(含21.8%脂肪和1.25%胆固醇)饮食和高脂混合西格列汀(0.3%w/w)饮食,各喂养16周。2、实验分组：第1组：对照组,8周龄雄性ApoE-/-小鼠共12只,喂养高脂饲料共16w；第2组：西格列汀组,8周龄雄性ApoE-/-小鼠共12只,喂养高脂混合西格列汀饲料(0.3%w/w)共16w；3、每周记录小鼠体重和进食量,14周时禁食16h后腹腔注射20%葡萄糖注射液(1g/kg)后分别测Omin,15min,30min,60min和120min时小鼠尾静脉的血糖水平。4、喂养16周后,禁食8h后腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(5ul/g),小鼠麻醉后摘眼球取血,室温静置30min后,离心3000rpm,10min,取血清,-80度冻存,分别用ELISA方法和全自动生化检测仪检测血清中血脂谱水平和可溶性粘附分子的表达水平。5、取血后采用脊椎脱臼法处死小鼠,解剖并分离出小鼠主动脉至腹主动脉分叉处,往小鼠左心室内注入0.9%生理盐水,冲洗主动脉,在解剖显微镜下由下而上剖开后再滤纸上铺开,用4%福尔马林固定液固定36h后,苏丹Ⅳ染液染色10min后放入70%乙醇溶液中分化10min,再用清水漂洗20min,放入两片载玻片中,在解剖显微镜下用相机拍照。6、小鼠主动脉分离后用4%福尔马林固定液固定24h,采用石蜡切片的方法将主动脉制成平片后分别用Masson特殊染色法和免疫组化的方法检测主动脉斑块中胶原纤维、巨噬细胞和平滑肌细胞的表达水平；小鼠主动脉分离后放入-80度冻存,部分组织提取蛋白后采用免疫印迹法方法检测主动脉组织中AMPK(AMPK和Akt)和MAPK(p38和Erkl/2)信号通路磷酸化蛋白与总蛋白的表达情况；部分组织提取RNA后采用RT-PCR的方法检测主动脉中DPP4和GLP-1R以及MCP-1和IL-1等炎症因子的表达情况。5、统计学处理：实验数据采用SPSS13.0进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两独立样本数据采用不配对的t检验进行比较,P<0.05认为差异具有统计学意义。[结果]1.两组间各代谢指标水平的比较：小鼠体重和进食量水平在两组间比较无显著性差异；腹腔糖耐量实验结果显示两组间的血糖水平在Omin、15min、30min、60min和120min五个时间点均无显著性差异；与对照组相比,西格列汀可升高血清中高密度脂蛋白(HDL)的水平(52.78±5.25vs97.76±8.56,P<0.001),但血清中甘油三酯(TG),总胆固醇(TC),低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)的表达水平在两组间比较无显著性差异。2.西格列汀对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成的影响以及西格列汀干预后斑块内各组成成分的改变：与高脂对照组相比,西格列汀组动脉粥样硬化斑块面积显著降低((7.64±1.98%vs12.91±1.15%,P<0.001)；主动脉弓和腹主动脉部位的动脉粥样硬化斑块面积也较对照组显著降低,与对照组相比,西格列汀组主动脉弓和腹主动脉的粥样斑块面积分别减少1.92和2.74倍(P=0.011和P=0.006)。西格列汀干预后,动脉粥样斑块内组织成分平滑肌细胞、巨噬细胞和胶原纤维的表达下降,与对照组相比,西格列汀组斑块内胶原纤维表达减少(49.86±6.26um2vs59.83±5.82um2；P<0.05)；西格列汀干预后斑块内平滑肌细胞和巨噬细胞表达有减少的趋势,但与对照组相比无统计学差异。3、西格列汀对ApoE-/-小鼠血清可溶性粘附分子表达水平的影响：西格列汀可抑制血清中可溶性粘附分子的表达。与对照组相比,小鼠血清中可溶性粘附分子VCAM-1和P-slectin的表达显著下降,差异具有统计学意义(sVCAM-1:1163.16±159.62ng/mlvs1365.18±170.26ng/ml,P<0.05;sP-selectin:232.71±64.29ng/mlvs288±44.46ng/ml,P<0.05)。4、西格列汀对ApoE-/-小鼠主动脉组织中DPP-4、GLP-1R、MCP-1和IL-6表达的影响：两组间主动脉组织DPP-4和GLP-1RmRNA表达水平均无显著性差异(P>0.05);而炎症因子MCP-1和IL-6的表达情况在西格列汀组均出现显著性减少,差异具有统计学意义(P=0.001andP=0.033)。5、西格列汀对ApoE-/-小鼠主动脉组织中AMPK和MAPK磷酸化蛋白表达的影响：与对照组相比,西格列汀组小鼠主动脉组织中AMPK及其下游信号通路Akt的磷酸化蛋白表达与总蛋白表达的比值增加,差异具有统计学意义(P<0.05andP<0.01)；而MAPK信号通路p38和Erk1/2磷酸化蛋白表达与总蛋白表达的比值下降,差异也具有统计学意义(P<0.05andP<0.01)。[结论]1、西格列汀可延缓ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生发展,并减少斑块中组成成分的表达,该作用独立于降糖和降体重之外。2、西格列汀可增加ApoE-/-小鼠血清中HDL的表达水平。3、西格列汀延缓动脉粥样硬化作用的机制可能与激活AMPK-Akt信号通路以及抑制p38和Erkl/2MAPK信号通路,从而导致炎症因子(MCP-1和IL-6)和粘附分子(sVCAM-1和sP-selectin)表达减少相关。第二部分DPP-4抑制剂西格列汀对血管内皮特异性PKCβ2过表达的ApoE基因敲除(VEPKCβ2+/-ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化的影响及机制初探[目的]1、观察血管内皮特异性PKCβ2过表达对动脉粥样硬化病变的影响并探讨可能存在的作用机制。2、观察DPP-4抑制剂西格列汀对血管内皮特异性PKCβ2过表达的ApoE基因敲除(VEPKCp2+/-ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化病变的影响。3、探讨西格列汀影响血管内皮特异性PKCβ2过表达的ApoE基因敲除(VEPKCβ2+/-ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化形成潜在的作用机制。[方法]1、制备VEPKCβ2+/-/ApoE-/-杂交小鼠：将血管内皮细胞特异性PKCβ2过表达的转基因(VEPKCβ2+/-)小鼠与载脂蛋白E基因敲除的C57BL6/J(ApoE-/-)小鼠进行多次杂交并做基因鉴定之后,制备出具有ApoE-/-背景的VEPKCβ2转基因(VEPKCβ2+/-ApoE-/-)小鼠作为小鼠实验模型。2、取12只8周龄的雄性ApoE-/-小鼠作为阴性对照,给予高脂饮食(含21.8%脂肪和1.25%胆固醇)喂养16周：再取24只8周龄的雄性VEPKCβ2+/-ApoE-/-小鼠作为实验对象,随机分成两组,每组12只,分别给予高脂饮食和高脂混合西格列汀(0.3%w/w)饮食,均喂养16周,动物分组及饲料喂养如下。3、实验分组：第1组：12只8周龄雄性ApoE-/-小鼠,高脂饮食16w,简称高脂对照组；第2组：12只8周龄雄性VEPKCβ2+/-ApoE-/-小鼠,高脂饮食16w,简称高脂模型组；第3组：12只8周龄雄性VEPKCβ2+/-ApoE-/-小鼠,高脂混合西格列汀饮食16w,简称西格列汀模型组；4、每周记录小鼠体重和进食量,14周时行腹腔糖耐量实验(IPGTT)测0min,15min,30min,60min和120min五个时间点的血糖水平。5、喂养16周后,禁食8h后麻醉,摘眼球取血,离心取血清,-80度冻存,分别用全自动生化检测仪和ELISA方法检测血清中血脂谱水平和可溶性粘附分子的表达水平。6、取血后采用脊椎脱臼法处死小鼠,解剖并分离出小鼠主动脉至腹主动脉分叉处,剖开动脉后,铺开进行固定后用苏丹Ⅳ染液染色,用高清摄像系统拍照后用软件计算动脉粥样硬化斑块占血管面积的百分比。7、小鼠主动脉分离固定后,石蜡切片将主动脉制成平片后分别用Masson特殊染色法和免疫组化的方法检测主动脉斑块中胶原纤维、巨噬细胞和平滑肌细胞的表达水平；采用RT-PCR的方法检测主动脉组织中PKCβ、DPP4和GLP-1R基因nRNA的表达情况；采用免疫印迹法方法检测主动脉组织中AMPK和β38MAPK信号通路蛋白磷酸化的表达情况。8、统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行处理,各指标数据采用均数±标准差(x±s)表示,各组均数比较采用单向方差分析(One-wayANOVA),多重比较采用LSD法(Least-significantdifferencetest),方差不齐时,用Welch法校正,当P<0.05时用Dunnett’sT3法作多重比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、三组间各代谢指标的比较：小鼠体重、进食量以及IPGTT在Omin、15min、30min、60min和120min五个时间点的血糖水平在三组间比较均无显著性差异。血清TG、TC、HDL、LDL和VLDL的表达水平在高脂对照组和高脂模型组之间比较均没有显著性差异；但西格列汀模型组与高脂模型组相比,血清中HDL的表达水平显著升高(86.69±14.61vs60.81±10.82,P<0.0001),而血清中TG、TC、LDL和VLDL的表达水平在西格列汀模型组与高脂模型组中没有差异。2、血管内皮特异性PKCβ2过表达对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积形成的影响,以及西格列汀干预后VEPKC+/β-ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积形成的改变：与高脂对照组相比,高脂模型组动脉粥样硬化斑块面积比显著增加(23.58±5.31%vs12.91±1.15%,P<0.0001)；而西格列汀模型组与高脂模型组相比较,动脉粥样硬化斑块面积比减少,差异具有统计学意义(16.19±2.07%vs23.58±5.31%,P<0.01)；高脂对照组与西格列汀模型组相比斑块面积比没有差异(P=0.112)。与高脂对照组相比,主动脉弓部和腹主动脉中斑块面积比在高脂模型组均有增加的趋势(30.64±14.9%vs21.31±7.45%；12.33±4.7%vs11.06±3.93%)；而与高脂模型组相比,西格列汀模型组主动脉弓部和腹主动脉中斑块面积比均呈现减少的趋势(20.23±4.38%vs30.64±14.9%；9.98±3.75%vs11.06±3.93%),但统计结果显示主动脉弓部和腹主动脉中斑块面积比在三组间的差异均没有统计学意义(P>0.05)。3、三组间粥样斑块内各组成成分的改变：与高脂对照组相比,高脂模型组动脉粥样硬化斑块内各组成成分的表达均呈现增加的趋势(平滑肌细胞：28.28±6.56vs22.74±5.11um2巨噬细胞：4.45±1.32vs2.91±2.01um2；胶原纤维：66.60±16.16vs59.83±5.82%)；西格列汀模型组与高脂模型组相比,斑块内各组成成分(平滑肌细胞、巨噬细胞和胶原纤维)的表达则呈现减少的趋势(平滑肌细胞：23.28±3.03vs22.74±5.11；巨噬细胞：3.31±1.38vs2.91±2.01；胶原纤维：52.59±8.65vs59.83±5.82),但统计结果显示斑块内平滑肌细胞、巨噬细胞和胶原纤维在三组间的表达差异均没有统计学意义。4、三组间小鼠主动脉组织中PKCβ、DPP4和GLP-1RmRNA表达水平的比较：三组之间主动脉组织中DPP-4和GLP-1RmRNA的表达水平均无显著性差异(P>0.05)。高脂模型组和西格列汀模型组的PKCp基因的mRNA表达水平分别是高脂对照组的5.18倍(P=0.012)和5.21倍(P=0.035)；高脂模型组和西格列汀模型组之间的PKCβ基因mRNA的表达水平无显著性差异(P>0.05)。5、三组间血清可溶性粘附分子(sVCAM-1和sP-selectin)表达水平的比较：血管内皮特异性PKCβ2过表达后与高脂对照组相比较,小鼠血清中可溶性粘附分子VCAM-1和P-selectin表达水平显著增加(2157.12±553.37vs1365.18±170.26,P<0.001；429.01±102.89vs288.00±44.46,P<0.001),给予西格列汀干预后血清中sVCAM-1的表达显著下降(1838.20±374.86vs2157.12±553.37,P<0.05),而血清中sP-selectin的表达水平出现下降的趋势,但无统计学差异(383.30±63.60vs429.01±102.89,P=0.181)。6、三组间小鼠主动脉组织中AMPK和p38MAPK磷酸化蛋白表达水平的变化：与高脂对照相比,高脂模型组小鼠主动脉组织中AMPK的磷酸化蛋白与总蛋白(pAMPK/AMPK)表达比值下降4倍(P=0.023),而VEPKCβ+/-ApoE-/-小鼠在给予西格列汀干预后pAMPK/AMPK的比值增加5.56倍数(P=0.008),差别均具有统计学意义；三组间p38MAPK蛋白的磷酸化表达水平则与AMPK蛋白磷酸化表达的趋势相反,高脂模型组中p38MAPK的磷酸化蛋白与总蛋白(pp38/p38)表达比值是高脂对照组的1.66倍(P=0.033),而VEPKCβ+/-ApoE-/-小鼠在给予西格列汀干预后pp38/p38的比值下降3.02倍(P=0.002),差别也具有统计学意义。[结论]1、血管内皮特异性PKC02过表达可促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生发展,该作用独立于降糖、降脂和降体重作用之外。2、血管内皮特异性PKCβ2过表达促进ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的机制可能与影响血清中可溶性粘附分子表达,从而增加白细胞和血管之间的相互作用有关。3、西格列汀可延缓血管内皮特异性PKCβ2过表达的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块面积的形成。4、西格列汀延缓VEPKCβ+/-ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用机制与PKC途径的活化无关,而可能与激活AMPK信号通路以及抑制MAPK信号通路,导致粘附分子表达减少相关。
【作者】曾艳梅；
【导师】薛耀明；
【作者基本信息】南方医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】西格列汀；动脉粥样硬化；AMPK信号通路；MAPK信号通路；炎症因子；粘附分子；血管内皮特异性PKCβ过表达；ApoE基因敲除；

【参考文献】
[1]王帅旗.船舶驾驶室布置人机工程设计及其应用[D].哈尔滨工程大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[2]王丽红.模因理论在大学英语写作中的应用研究[D].渤海大学,课程与教学论,2013,硕士.
[3]袁博.纳米电子系统的容缺陷设计方法研究[D].中国科学技术大学,2014.
[4]邢永忠,吴晓蓓,徐志良.基于柯西分布加权的最小二乘支持向量机[J].控制与决策,2009,06:937-940.
[5]王树龙.抗肾小球基底膜病临床特点分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[6]吴震宇.从瘀论治非酒精性脂肪肝的理论探讨及三七治疗的实验研究[D].北京中医药大学,中医内科学,2013,硕士.
[7]靳远茜.商事仲裁第三人制度研究[D].太原科技大学,诉讼法学,2013,硕士.
[8]袁秀.内蒙古白雁湖化工股份有限公司发展战略研究[D].内蒙古大学,高级管理人员工商管理,2013,硕士.
[9]樊海博.基于NestedLogit的小汽车通勤出行转移模型研究[D].北京交通大学,2014.
[10]刘静静.唐代江南地区佛教文化环境与诗歌创作[D].西北大学,中国古代文学,2013,硕士.
[11]孙杰.高校专项经费绩效管理的研究[D].江苏科技大学,会计学,2014,硕士.
[12]赵乾钊.中国电气化铁路的发展[J].中国铁路.1993(09)
[13]汤鹏志,王森.数据仓库的体系建设[J].计算机与现代化,2005,05:57-58+61.
[14]马健.一种基于GPS采集处理系统的研究[D].渤海大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[15]孟素荷.对中国冷冻冷藏食品工业发展的思考[J].食品工业科技.2005(08)
[16]王立霞.韩国语指示词“（？）”和汉语“这/那”的对照研究[D].复旦大学,亚非语言文学,2012,硕士.
[17]李铭.光伏并网发电系统控制策略的研究[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[18]李谷.人民币外汇期权市场及产品实务应用[D].上海交通大学,工商管理,2013,硕士.
[19]薛佳怡.顺应论视角下的口译策略[D].苏州大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[20]王岚.夫妻分居期间财产关系问题研究[D].湖南师范大学,民商法学,2013,硕士.
[21]张雪.任务型教学法在初级对外汉语教学中的运用[D].西北大学,汉语国际教育（专业学位）,2014,硕士.
[22]阮莉莉.中国货币政策区域效应研究[D].西南大学,金融学,2013,硕士.
[23]王建新,姚益江,陈晓莉.PLC在原料场大型取料机上的应用[J].冶金自动化,2003,01:69-70.
[24]吴聿婷.试析冷战后蒙古国的“多支点”外交政策[D].华中师范大学,国际关系,2013,硕士.
[25]张嫣.混合多层分布式发电厂故障分析与继电保护整定综合系统[D].福州大学,电力系统及其自动化,2004,硕士.
[26]傅易德.冷轧退火线计算机系统无负荷试运转[J].冶金自动化,1991,06:16-19+60.
[27]赵杨.《经济与法》栏目定位与创作理念分析[D].兰州大学,新闻与传播（专业学位）,2013,硕士.
[28]胡永津.基于Android的航班行李PDA应用系统的设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[29]周巍.关于何纪光“新型湖南高腔山歌唱法”的研究[D].湖南师范大学,音乐学,2004,硕士.
[30]严金满.非酒精润湿液添加剂的开发[J].出版与印刷.1995(01)
[31]杜树增.我国通货膨胀与通货膨胀不确定性关系问题研究[D].山东财经大学,西方经济学,2013,硕士.
[32]康露.歌剧《茶花女》两个版本中薇奥莱塔的初步对比研究[D].西安音乐学院,声乐演唱,2014,硕士.
[33]元方.地方政府网络舆情危机应对策略研究[D].郑州大学,行政管理,2013,硕士.
[34]李正浩.基于SAE J1939协议拖拉机综合信息显示系统开发与设计[D].南京农业大学,车辆工程,2011,硕士.
[35]杜芳.脉搏灌注指数变异预测全麻复合硬膜外麻醉容量治疗反应性的研究[D].复旦大学,临床医学（专业学位）,2013,博士.
[36]万红新,彭云,聂承启.在关系数据库中提取关联规则的实现方法[J].江西教育学院学报(综合),2004,03:37-39.
[37]徐丽倩,李江,李璐璐,李剑平,刘晓璐,何勇,邓丹凤,裘云庆.茶多酚和黄芩苷对百草枯中毒大鼠血清及肺组织TGF-β1和HIF-1α表达的影响[J].浙江中西医结合杂志,2014,09:757-760+764+743.
[38]叶方德.考虑离散性的导电聚合物电导率的计算[D].郑州大学,凝聚态物理,2013,硕士.
[39]杨健国.MY石化公司绩效考核优化研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[40]孙金婷.微卫星标记技术定性、定量鉴定动物源性成分的应用研究[D].南京农业大学,临床兽医学,2011,硕士.
[41]程兵.基于FPGA的光分组交换边缘节点的研究[D].华中科技大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[42]朱强.大跨径连续梁桥支座更换的研究[D].华南理工大学,建筑与土木工程,2012,硕士.
[43]漆建华,姚永君,龚建华.综合测井与地震资料的储层反演[J].吐哈油气.2000(02)
[44]周汐.低碳经济发展模式下的碳税制度研究[D].北方工业大学,法律,2014,硕士.
[45]刘燕燕.《人民日报》成语使用情况历时考察与研究[D].河北大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[46]梁星亮.阿贝尔范畴中的正合性和自然性讨论[D].浙江大学,基础数学,2013,硕士.
[47]崔小宇.我国少数民族特需用品产业发展研究[D].内蒙古科技大学,区域经济学,2013,硕士.
[48]董鹤.高级别宫颈上皮内瘤变锥切术后残留或复发的高危因素的Meta分析[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[49]张诗渝.肺炎克雷伯杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性研究[D].南京农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[50]李伟.大连市车辆购置税管理信息系统规划研究[D].大连理工大学,2004.