跑台运动对大鼠膝关节软骨全层缺损修复重塑影响的实验研究

【摘要】关节软骨是构成滑膜关节的重要组成部分,其主要功能是传导分布运动载荷、维持和承受接触应力以及顺利完成关节功能活动等。各种骨关节创伤和骨肿瘤等疾病均可导致软骨缺损。由于软骨组织结构特殊,其内无神经、血管、淋巴管,幼年关节软骨可由软骨下通路获得部分营养,而成年关节软骨没有软骨下营养通路,一旦损伤,其修复能力有限,最终导致关节炎,影响关节功能。因而一直以来,关节软骨缺损修复成为国内外医学界高度关注和迫切需要解决的问题。目前软骨缺损的治疗方法很多,有药物疗法,生物疗法,外科手术方法、组织工程化软骨的合成与替代等。随着生物医学的发展,生物治疗越来越受到重视,软骨细胞移植、细胞因子移植、组织工程化软骨等方法的研究不断深入,目前多限于基础研究,临床研究及应用尚未成熟,其长期疗效尚有待进一步明确。外科手术方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植术、同种异体移植、骨膜及软骨膜移植术等,有报道取得了可喜的疗效,但修复的组织远远达不到正常软骨的组织结构,生物力学性能相差甚远,功能也自然严重欠缺,而且,随着时间的推移,这些组织逐渐出现退变,最终导致关节功能丧失。因此,如何改善关节软骨缺损修复的质量越来越受到研究者的关注,成为软骨缺损治疗的一个重要方面。成年关节软骨没有软骨下营养通路,软骨的营养供给是通过关节活动产生的压力变化,使滑液在关节腔与软骨基质之间进行交流。很多实验证明,制动可导致关节软骨退变,但对其发生机理不但与关节活动有关,还与关节的负重密切相关。有学者提出两种假设：(1)“软骨泵”营养机制不仅需要关节活动,同时还需要一定量的应力,缺乏足够的应力,即使保留关节活动,软骨仍不能有效地获取营养。(2)软骨细胞存在某种应力感受装置,维持软骨细胞的正常生理活动需要一定量的应力刺激。制动后关节内应力异常,除对合面有持续静止应力存在外,其余的软骨表面缺乏应力刺激,持续低应力本身即可导致软骨退变。目前普遍认为,关节软骨细胞的正常生理功能与其受到的正常应力刺激密切相关,运动可以改善修复软骨的质量。制动和关节负荷加重均导致关节软骨退变。运动可促进全层软骨缺损的修复。软骨细胞对力学刺激敏感,稳定的压力将抑制软骨细胞对基质蛋白的合成,而周期变化压力刺激其合成。所以关节活动对软骨营养传递极其重要。关节活动造成关节软骨受压与减压交替出现,形成所谓“软骨泵”的软骨营养机制。运动可以降低关节内压力,有利于滑液向软骨表面和细胞间质弥散,提供软骨修复的最佳内环境,促进软骨修复。已有学者研究了运动对膝关节软骨的影响,大部分结果表明运动对软骨的修复是有利的,而也有部分研究表明运动并不能促进软骨的修复。我们仔细研读了这些文献,发现他们对于运动的强度、运动介入的时间以及确定运动强度的标准等方面存在较大差异,这也许是导致最终得出不同研究结果的原因所在,而运动的不同强度及不同介入时间对软骨缺损修复的影响尚未有报道。软骨细胞合成、分泌软骨基质前体物质的正常生理过程一定程度上受到应力大小的调控,软骨细胞在缺乏足够应力刺激时,就会出现合成与分泌功能下降和软骨细胞退变。全层软骨缺损修复的机理为：软骨下骨的出血导致缺损区内血肿形成,同时基底部松质骨内有多种功能的间充质细胞增殖,缺损区为含红细胞、白细胞和未分化细胞的纤维素凝块填充,凝块进一步形成肉芽组织,肉芽组织化生成纤维软骨,后再转化为类透明软骨。全层小软骨缺损的修复分为几个阶段：术后2天即见间充质细胞长入,4周出现纤维软骨,8周出现透明软骨,12周开始退化。目前的研究多集中在被动运动对软骨缺损修复的影响,主动运动对软骨缺损修复的作用尚未见报道。本实验制作大鼠膝关节股骨滑车全层软骨缺损模型,在不同时间、采用不同强度的跑台运动,观察跑台运动对大鼠膝关节全层软骨缺损修复重塑的影响,以期为临床软骨损伤的治疗和康复提供实验依据。本实验包括三部分,第一部分探讨不同强度的跑台运动对大鼠膝关节软骨全层缺损早期修复的影响,并探讨其修复的机制；第二部分将探讨不同运动介入时间对大鼠膝关节软骨全层缺损修复重塑的影响；第三部分探讨不同强度跑台运动对大鼠膝关节软骨全层缺损修复重塑的影响。第一部分跑台运动对大鼠膝关节软骨全层缺损早期修复的影响目的：探讨不同强度运动对大鼠髌股关节软骨全层缺损修复早期的影响；探讨不同强度运动对大鼠髌股关节软骨缺损修复早期血清MMP-3、TIMP-1表达的影响。材料与方法：1、造模：6周龄清洁级雄性SD大鼠24只,在大鼠膝关节股骨远端髌股关节面距离髁间窝2mm处做一直径为lmm的全层软骨缺损模型,随机分为安静组(SED)、低强度运动组(LIR)、中强度运动组(MIR)和高强度运动组(HIR),每组6只。2、跑台运动干预：造模后一周创口愈合后,低、中、高强度运动组分别进行相应强度的跑台运动。低强度跑台运动为跑台坡度0。,速度8.2m/min;中等强度跑台运动为坡度5。,速度15.2m/min;高强度跑台运动为跑台坡度10。,速度26.7m/min;各运动组每天运动40min,周一至周五训练,周六、日休息。安静组笼内饲养,自由活动。3、标本取材：实验前即初次跑台运动前24小时采用断尾取血法取血,末次运动后采用心脏取血法取血,低温离心,收集血清于EP管,-80℃保存。运动后以软骨缺损区为中心,在股骨中下段冠状位切取股骨远端,将其中一侧做石蜡包埋切片,另一侧膝关节用消毒的手术刀切下软骨缺损区的修复组织,-80℃保存。4、指标检测：修复组织的大体观察：组织切片染色；修复组织O’Driscoll评分；ELISA法测定血液MMP-3、TIMP-1浓度及TIMP-1/MMP-3比值。5、统计学分析：采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,实验数据以均数±标准差表示,组间差异比较采用单因素方差分析,若方差齐,用Bonferroni法进一步两两比较,组内实验前后比较采用配对样本t检验,浓度比值采用Kruskal-WallisH秩和检验；当P≤0.05时认为差异有统计学意义。结果：大体观及组织切片染色显示安静组修复情况最好,细胞及基质较多；O’Driscoll评分显示安静组得分最高,各运动组均低于安静组,差异有统计学意义(F=234.349,P=0.000),高强度运动组得分最低；ELISA结果显示实验前各组之间MMP-3浓度差异无统计学意义(F=0.065,P=0.978),实验前各组之间TIMP-1浓度差异无统计学意义(F=0.580,P=0.635),实验后各组之间血液MMP-3浓度比较差异有统计学意义(F=32.469,P=0.000),HIR组显著高于其他3组,SED组最低；TIMP-1浓度各组间有显著性差异(F=20.195,P=-0.000)；实验后,TIMP-1/MMP-3浓度比值组间差异有统计学意义(χ2=15.380,P=0.002)。结论：本部分实验证实,对于大鼠膝关节全层软骨缺损,低、中、高强度运动均抑制大鼠髌股关节全厚软骨缺损的早期修复,高强度运动进一步破坏软骨下骨,MMP-3、TIMP-1表达与运动相关,TIMP-1/MMP-3值与软骨修复的程度一致。而不同运动时机及不同运动强度对软骨全层缺损修复的影响值得进一步深入的研究。第二部分不同跑台运动介入时间对大鼠膝关节软骨全层缺损修复重塑影响的实验研究目的：观察不同时期跑台运动对软骨缺损修复的影响；为临床软骨损伤后关节负重及功能锻炼时间提供实验依据。材料与方法：1、造模：8周龄清洁级雄性SD大鼠40只,在大鼠膝关节股骨远端髌股关节面距离髁间窝2mm处做一直径为1mm的全层软骨缺损模型,随机分为安静组(SED)、造模后2周运动组(2W)、造模后4周运动组(4W)和造模后8周运动组(8W),每组10只。2、跑台运动干预：造模后笼内饲养,2W组、4W组、8W组分别在造模后2周、4周、8周进行中等强度跑台运动：坡度5。,速度15.2m/min,每天运动40min,周一至周五训练,周六、日休息。安静组笼内饲养,自由活动。3、标本取材：造模后10周和14周,每组分别处死5只大鼠。以软骨缺损区为中心,在股骨中下段冠状位切取股骨远端,将其中一侧做石蜡包埋切片,另一侧膝关节用消毒的手术刀切下软骨缺损区的修复组织,-80℃保存。4、指标检测：修复组织的大体观察；组织切片染色；修复组织O’Driscoll评分；免疫组织化学法测定修复组织的Ⅱ型胶原含量；qPC测定修复组织Ⅱ型胶原及糖苷多糖含量。5、统计学分析：实验数据分析采用SPSS13.0统计学软件,对于计量资料采用均数±标准差表示,对于多组之间的比较采用析因设计资料的方差分析,方差齐时整体的比较采用F检验,多重比较采用Bonferroni法,方差不齐时采用FriedmanM检验,多重比较采用对应的非参数多样本q检验。当P≤0.05时认为差异有统计学意义。结果：大体观及组织切片染色显示4W组修复情况最好；O’Driscoll评分显示4W组得分最高,2W组得分最低,总体比较,各组间有统计差异(F=31.394,P=0.000),不同时间有统计差异(F=22.347,P=0.000)；所有组合的交互效应无显著性差异(F=0.287,P=0.835)；4W组O’Driscoll组织学评分造模后14周与造模后10周有显著性差异(t=-6.500,P=0.003)；免疫组织化学结果显示4W组修复组织Ⅱ型胶原含量最高,2W组含量最低,各组间有统计差异(F=249.063,P=0.000),不同时间有统计差异(F=41.519,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=28.512,P=0.000),2W组显著低于SED组,差异有统计学意义(P=0.000),8W组高于SED组,但差异无统计学意义(P=0.497)。qPCR结果显示4W组修复组织Ⅱ型胶原及糖胺多糖含量最高,2W组含量最低,各组间有统计差异(F=236.601,P=0.000),不同时间有统计差异(F=3.150,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=3.601,P=0.024)。造模后10周4W组显著高于SED组和2W组,差异有统计学意义(P=0.000),造模后14周4W组显著高于SED组和2W组,差异有统计学意义(P=0.000)。结论：本实验结果表明,在正确的时机进行中等强度的运动能够促进软骨缺损的修复,提高修复组织的质量,缩短修复时间；过早的运动不但不能促进软骨缺损的修复,还会对软骨修复过程造成负面影响；而延迟进行运动则对软骨修复的作用有限。本实验为临床软骨缺损患者的治疗和康复提供了实验依据,但由实验到临床的路还很长,运动影响软骨修复的机制及远期效果需要进一步的深入研究。第三部分不同强度跑台运动对大鼠全层软骨缺损修复重塑影响的实验研究目的：探讨不同强度跑台运动对大鼠膝关节软骨全层缺损修复重塑的影响；探讨运动对软骨全层缺损修复重塑影响的作用机制；为临床软骨损伤的运动疗法提供实验依据。材料与方法：1、造模：8周龄清洁级雄性SD大鼠40只,在大鼠膝关节股骨远端髌股关节面距离髁间窝2mm处做一直径为1mm的全层软骨缺损模型,随机分为安静组(SED)、低强度运动组(LIR)、中强度运动组(MIR)和高强度运动组(HIR),每组10只。2、跑台运动干预：造模后4周,低、中、高强度运动组分别进行相应强度的跑台运动。低强度跑台运动为跑台坡度0。,速度8.2m/min;中等强度跑台运动为坡度5。,速度15.2m/min;高强度跑台运动为跑台坡度10。,速度26.7m/min;各运动组每天运动40min,周一至周五训练,周六、日休息。安静组笼内饲养,自由活动。3、标本取材：造模后10周和14周,每组分别处死5只大鼠。以软骨缺损区为中心,在股骨中下段冠状位切取股骨远端,将其中一侧做石蜡包埋切片,另一侧膝关节用消毒的手术刀切下软骨缺损区的修复组织,-80℃保存。4、指标检测：修复组织的大体观察；组织切片染色；修复组织O’Driscoll评分；免疫组织化学法测定修复组织的Ⅱ型胶原含量；qPCR测定修复组织Ⅱ型胶原及糖苷多糖含量,BMP及GIF含量。5、统计学分析：实验数据分析采用SPSS13.0统计学软件,对于计量资料采用均数±标准差表示,对于多组之间的比较采用析因设计资料的方差分析,方差齐时整体的比较采用F检验,多重比较采用Bonferroni法,方差不齐时采用FriedmanM检验,多重比较采用对应的非参数多样本q检验。当P≤0.05时认为差异有统计学意义。结果：大体观及组织切片染色显示MIR组修复情况最好,细胞及基质较多；O’Driscoll评分显示MIR组得分最高,HIR组得分最低,各组间有统计差异(F=214.901,P=0.000),不同时间有统计差异(F=17.695,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=11.041,P=0.000)。进一步进行多重比较显示,造模后10周,MIR组与SED组有显著性差异(P=0.002),造模后14周,MIR组与SED组有显著性差异(P=0.000)。修复软骨组织Igf-1的基因表达,各组间有统计差异(F=546.877,P=0.000),不同时间有统计差异(F=13.287,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=10.769,P=0.000)。修复软骨组织BMP-2的基因表达,各组间有统计差异(F=894.898,P=0.000),不同时间有统计差异(F=12.927,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=12.157,P=0.000)。修复软骨组织糖胺多糖的基因表达统计显示,各组间有统计差异(F=916.688,P=0.000),不同时间有统计差异(F=45.748,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=55.689,P=0.000)。修复软骨组织Ⅱ型胶原的基因表达,各组间有统计差异(F=709.227,P=0.000),不同时间有统计差异(F=20.641,P=0.000)；所有组合的交互效应均有显著性差异(F=27.526,P=0.000)。结论：本部分实验结果表明,中等轻度跑台运动能促进大鼠膝关节软骨全层缺损的修复重塑,低强度运动对大鼠膝关节软骨全层缺损修复重塑促进作用有限,高强度跑台运动则对大鼠膝关节软骨全层缺损修复具有破坏作用。运动促进关节软骨全层缺损的机制可能为运动使关节内IGF和BMP的含量增多,从而促进了骨髓基质干细胞向关节软骨细胞分化,并促进软骨细胞分泌基质,最终促进了软骨缺损的修复重塑。
【作者】宋锦旗；
【导师】余斌；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】跑台运动；软骨；全层缺损；骨髓基质干细胞；二型胶原；糖胺多糖；

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