葛根素对转运体介导的甲氨蝶呤药代动力学、肾损伤、逆转K562/ADR细胞多药耐药的分子药代动力学机制

【摘要】第一部分应用LC-MS/MS建立同时测定生物样品中甲氨蝶呤和葛根素的分析方法目的：建立一种灵敏、快速、高效、专属的LC-MS/MS方法用于同时测定生物样品中甲氨蝶呤和葛根素的浓度。方法：生物样品经甲醇沉淀蛋白后,氮气吹干并复溶,应用HypersilODS-C18色谱柱分离,流动相为乙腈-甲酸水(40：60,v/v)；流速为0.3ml/min。采用电喷雾离子源(ESI源)多反应监测(MRM)模式,正离子扫描分析m/z455.2→308.2(甲氨蝶呤),m/z414.9→266.7(葛根素),m/z370.4→288.1(西洛他唑,内标)。结果：甲氨蝶呤和葛根素的线性范围为1～1000ng/ml,日内和日间精密度相对标准差均小于15%。结论：建立了灵敏、快速的LC-MS/MS法同时测定生物样品中的甲氨蝶呤和葛根素的浓度,并成功应用于药代动力学研究。第二部分葛根素影响甲氨蝶呤药代动力学的分子机制研究目的：揭示葛根素影响甲氨蝶呤药动学的分子机制,为临床合理用药提供科学指导。方法：采用大鼠invivo口服和静注、invitro翻转肠实验、肾切片摄取实验以及MDR1-MDCK细胞转运实验、OAT1/3-HEK293细胞摄取实验考察葛根素对甲氨蝶呤药代动力学的影响和分子机制,生物样品中葛根素和甲氨蝶呤的含量应用LC-MS/MS检测。结果：合用葛根素后,甲氨蝶呤的口服生物利用度提高了58%,静注甲氨蝶呤时肾脏清除率显著下降(从1.91±0.09ml/min下降为0.82±0.07ml/min)。葛根素可显著提高甲氨蝶呤的体外肠吸收,并抑制肾切片对甲氨蝶呤的摄取。同时,葛根素抑制MDR1-MDCK细胞外排地高辛转运的I(50为1.6gM,且可显著抑制甲氨蝶呤经MDR1-MDCK细胞的外排转运。此外,OAT1/3-HEK293细胞摄取葛根素与mock-HEK293没有差异,但葛根素可抑制OAT1/3-HEK293细胞对经典底物(PAH和PCG)和甲氨蝶呤的摄取。结论：葛根素影响甲氨蝶呤药动学的分子靶点为肠道P-gp和肾脏OATs,葛根素是P-gp和OATs的抑制剂,提示葛根素与甲氨蝶呤或其他P-gp及OATs底物合用时,可能发生潜在的药物相互作用。第三部分葛根素对甲氨蝶呤肾损害的影响及其分子药代动力学机制目的：通过多剂量的葛根素改善甲氨蝶呤引起的大鼠肾损伤探索转运体介导葛根素缓解肾损伤的分子药代动力学机制。方法：大鼠灌胃葛根素(50mg/kg/d)三天后,考察甲氨蝶呤药代动力学改变。此外,大鼠腹腔注射甲氨蝶呤(7mg/kg/d)三天后,葛根素灌胃治疗三天(50mg/kg/d),考察大鼠血清肌酐、尿素氮、硫酸吲哚吩的改变以及大鼠肾脏病理切片的变化。结果：葛根素给药后,甲氨蝶呤的血药浓度下降增快,肾切片对甲氨蝶呤的摄取增加。RealtimePCR实验表明葛根素诱导Oatl/3的表达,从而加快对甲氨蝶呤的肾清除。甲氨蝶呤连续给药后,血肌酐、尿素氮和硫酸吲哚酚等内源性代谢物质的血浆浓度升高,肾脏出现明显的病理改变。而合用葛根素并不能避免肾损害的发生,但是可加快内源性代谢物质的排泄,通过上调Oatl/3可改善肾组织的病理改变。同时,葛根素能部分逆转甲氨蝶呤处理后的BCL6表达下调和PEG2的表达上调。结论：葛根素可通过BCL6和PEG2上调Oat1/3,加快甲氨蝶呤的肾排泄,从而改善甲氨蝶呤诱导的肾毒性。第四部分葛根素抑制NF-κB通路逆转K562/ADR细胞多药耐药目的：探讨葛根素逆转K562/ADR细胞多药耐药的分子机制。方法：通过MTT、qRT-PCR、WesternBlotting、流式细胞术以及质粒转染等实验考察葛根素逆转K562/ADR细胞对阿霉素的耐药性及其分子机制。结果：K562/ADR对阿霉素的敏感性显著降低,并且MDR1/P-gp的表达分别增高了6.58和4.62倍。qRT-PCR和WesternBlotting实验结果证实,葛根素能够显著地增加K562/ADR对阿霉素的敏感性并下调K562/ADR细胞MDR1/P-gp的表达且呈时间依赖性和浓度依赖性。此外,分子机制研究结果表明葛根素可显著地抑制IκB-p的磷酸化。结论：葛根素可通过抑制IκB-β的磷酸化,抑制NF-κB通路并显著下调K562/ADR细胞MDR1/P-gp,进而逆转K562/ADR细胞对阿霉素的耐药。
【作者】刘琦；
【导师】刘克辛；
【作者基本信息】大连医科大学，中西医结合基础，2014，博士
【关键词】葛根素；甲氨蝶呤；药代动力学；OATs；肾脏损伤；PEG2；BCL-6；多药耐药MDR1NF-κB；

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