猪细环病毒与猪圆环病毒2型分子生物学特性研究

猪细环病毒与猪圆环病毒2型分子生物学特性研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-10-31 分类:参考文献 喜欢:3269
师大云端图书馆

【摘要】猪细环病毒(Torquetenosusviruses,TTSuV)和猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)在猪群中广泛分布。近年来研究表明,TTSuVs与PCV2混合感染率较高。PCV2能够引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)等猪圆环病毒相关疾病(Porcinecircovirusassociateddisease,PCVAD)。关于TTSuVs分子生物学研究甚少,本研究开展了TTSuVs遗传变异分析、抗原表位鉴定、感染性分子克隆构建、拯救毒株动物感染试验及病毒结构蛋白启动子等研究;此外还对PCV2衣壳蛋白(Capsid,Cap)中和抗原表位的关键氨基酸进行了解析。本研究旨在了解TTSuVs和PCV2的分子生物特性,为这两种病毒的协同感染致病性提供科学依据。TTSuVs是一种单股负链环状DNA病毒,临床流行的毒株间存在较大的基因差异,为了阐明该病毒在我国猪群中的遗传变异情况,本研究从临床送检的病料中,采用高保真PCR法扩增TTSuV1和TTSuV2基因组,将基因组克隆至pMD18-T载体中构建重组质粒,重组质粒酶切鉴定后测序。共获得8株TTSuV1和8株TTSuV2全基因组序列,长度约2.9kb;将获得的序列与GenBank下载的29株TTSuV1和40株TTSuV2基因组序列进行了对比,绘制了系统发育进化树。结果表明,TTSuV1被分为4个基因亚群;其中TTSuV1a亚群毒株间基因序列同源性为87.5~95.2%,TTSuV1b亚群毒株间基因序列同源性为83.8~99.9%,TTSuV1c亚群毒株间序列同源性为80.3~97.6%,TTSuV1d亚群仅有2个毒株序列,均来自国内。TTSuV2被分为4个基因亚型,其中TTSuV2a、TTSuV2b和TTSuV2d亚群中毒株间基因序列同源性均为86.7~99.7%,TTSuV2c亚群中仅含2个毒株序列,均来自国内。TTSuV1d、TTSuV2c和TTSuV2d这3个亚群是我国猪群中的特有毒株。本研究表明TTSuVs不同基因亚群毒株间有较高变异性。TTSuV1ORF1编码Cap蛋白,其诱导机体产生的抗体具有免疫保护作用。在遗传变异分析基础上,Liu等(2013)制备了针对TTSuV1-c亚群流行毒株的8株抗TTSuV1Cap蛋白的单克隆抗体(Monoclonalantibody,mAb)。本研究通过原核截短表达的Cap蛋白和合成肽扫描技术方法,对这些mAb对应的抗原表位进行了鉴定。结果表明,有7株单抗针对于同一个Cap抗原表位,其核心序列为536HPKYAGQGGGYTT548;另1株单抗(1E9)识别的抗原表位核心区序列为549EIGHQGITAASLR561。有趣的是,这2个抗原表位是毗邻的,但彼此独立。以含有抗原表位的C-3多肽作为包被抗原,建立了一种间接ELISA方法,用于检测临床猪血清中TTSuV1抗体。用该方法对临床送检200份猪血清样品检测结果表明,TTSuV1抗体阳性率达81.0%,表明该病毒在我国猪群中广泛流行,为进一步开展该病毒的流行病学调查提供了技术手段。为了寻找适合TTSuV1体外培养增殖的细胞系,以期获得TTSuV1纯毒株,本研究以克隆的TTSuV1-SY基因组为骨架,基因组内插入1个外源的SalI酶切位点,经酶切再环化后借助脂质体试剂转染ST和PK-15等细胞。对拯救克隆毒株鉴定结果显示,转染后48h能够检测到病毒抗原阳性细胞,该毒株(TTSuV1-SY)第2代和第3代细胞培养物仍能检测到病毒抗原阳性细胞,表明病毒拯救获得成功。但自第4代起无阳性细胞出现,表明拯救的毒株无法适应体外培养。为了阐明拯救毒株的Cap蛋白在细胞中抗原定位,用TTSuV1-SY转染细胞培养物,经抗病毒Cap的多抗和荧光标记二抗反应孵育,用共聚焦显微镜观察到该病毒Cap蛋白主要在细胞质内合成,随后转入细胞核内定位。Westernblotting分析表明,TTSuV1Cap蛋白分子量37kDa,与预测ORF1编码的蛋白差异较大,推断可能是病毒转录中存在mRNA剪辑。用拯救的TTSuV1-SY株第1代培养物接种30日龄SPF巴马猪3头,病毒接种后试验猪无明显临床症状,体温和体重与对照组无显著差异;病理学观察仅在腹股沟淋巴结有轻微的淋巴滤泡增生,肺脏有轻度间质性肺炎。PCR法检测试验猪小肠和肺脏中病毒核酸呈阳性,表明病毒在猪体内有复制。在TTSuV1ORF1前导序列区设计系列引物,PCR法扩增目的基因片段,借助pGL3-Basic载体和pRL-TK载体,用双荧光素酶报告基因检测系统验证TTSuV1ORF1前导区的启动子活性。结果表明,TTSuV1196nt~525nt序列能够启动萤火虫荧光素酶基因转录,证实这段序列内存在TTSuV1ORF1启动子。对上述序列进行截短,经精细鉴定证实该启动子核心区域为250nt~400nt。在TTSuV1基因组中缺失这段区域后影响蛋白质的表达,反向证实这段区域能够启动ORF1的转录。对TTSuV1ORF1编码区启动子的鉴定,为该病毒分子生物学研究奠定了基础。PCV2Cap蛋白是病毒主要结构蛋白,它能够诱导机体产生中和抗体,具有保护性抗原功能。先前获得的单抗8E4是针对PCV2Cap蛋白的,其具有中和病毒活性,针对的抗原表位为构象表位。Huang等(2011)研究证明,mAb8E4仅与PCV2a基因型的LG株、CL株和JF2株发生特异性反应,而不与PCV2b基因型毒株(YJ和JF)发生反应。本研究将PCV2b/JF株Cap蛋白的第59位精氨酸突变为丙氨酸后,突变毒株能够被mAb8E4识别和中和;同样将PCV2b/YJ株Cap蛋白的第59位精氨酸突变为丙氨酸,以及第60位的丙氨酸突变为苏氨酸后,突变毒株也能够被8E4mAb识别和中和。本研究证实PCV2Cap蛋白中的第59位和第60位氨基酸参与构象表位的形成;并且在PCV2b毒株(JF和YJ)中突变第59位氨基酸或第59/60位氨基酸后能够产生新的中和表位。本研究为进一步确定该中和构象表位和对PCV2不同基因型毒株抗原差异分型提供了科学依据。综上所述,我国猪群中TTSuVs毒株构成复杂,遗传变异率较高;基于TTSuV1Cap蛋白抗原表位序列合成多肽抗原,建立了一种检测该病毒抗体的间接ELISA方法;以感染性克隆技术拯救出TTSuV1-SY毒株,经PK-15和ST细胞体外传代证明该毒株体外培养适应性不强、增殖能力弱,接种试验猪无明显致病性;TTSuV1ORF1启动子的鉴定为该病毒分子生物学研究奠定了基础。此外,本研究阐明了PCV2Cap蛋白中第59位和第60位氨基酸是决定中和构象表位的关键氨基酸。
【作者】刘建波;
【导师】刘长明;
【作者基本信息】中国农业科学院,预防兽医学,2014,博士
【关键词】猪细环病毒;猪圆环病毒2型;抗原表位;感染性克隆;分子特性;

【参考文献】
[1]夏瑜.关于构建我国信托业风险管理体系研究[D].吉林财经大学,金融学,2014,硕士.
[2]于婷婷.美国内战中联邦政府的海上封锁政策[D].渤海大学,世界史,2014,硕士.
[3]吴静.用于逆转肿瘤多药耐药的纳米药物载体的研究[D].天津医科大学,2012.
[4]刘文捷.企业社会责任、企业生命周期与绩效[D].天津商业大学,会计学,2013,硕士.
[5]于洪凤.信息技术能力与知识管理能力对供应链绩效的影响研究[D].吉林大学,企业管理,2013,硕士.
[6]宋世斌.主成分模糊神经网在高校科研创新能力评价中的研究与应用[D].南京理工大学,模式识别与智能系统,2011,硕士.
[7]谢磊.酯化三乙醇胺类新型水泥助磨剂的应用研究[D].北京交通大学,2010.
[8]亓占中.CA916798基因通过PI3K/AKT/mTOR通路参与顺铂耐药的机制研究[D].第三军医大学,内科学,2012,硕士.
[9]邵宝辉.沈从文文学理论批评研究[D].河北大学,中国现当代文学,2003,硕士.
[10]周五一.A/O型污水土地生物过滤工艺的试验研究[D].青岛理工大学,环境工程,2012,硕士.
[11]AsimAhmedIbrahim.Factors Affecting Saudi Arabian Small Scale Business Enterprenuers Doing Business in China[D].苏州大学,INTERNATIONALBUSINESS(专业学位),2014,硕士.
[12]钱玉琼.隆回方言量词研究[D].华中科技大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[13]林勇.基于元数据的城市空间数据互操作技术研究[D].重庆大学,2001.
[14]杨海涛,任肖,成昭华.均一LaFeO_3/石墨烯复合纳米结构的制备和可见光催化性能研究[A].中国真空学会.中国真空学会2014学术年会论文摘要集[C].中国真空学会:,2014:1.
[15]刘淑敏.过渡金属硫化物及其复合材料的合成和电化学性能研究[D].长春理工大学,2014.
[16]张洪岩励惠国.数字地球时代的地理信息科学[N].中国测绘报,2002-01-01003.
[17]杨花花.CO_2直接甲酯化负载型催化剂制备及其过程强化[D].重庆大学,化学,2014,硕士.
[18]李捐.基于单目视觉的移动机器人SLAM问题的研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[19]赵艳.基于《现代汉语逆序词典》的同素逆序异义词研究[D].华中师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[20]陈美含.西盟佤族木鼓舞的文化变迁[D].云南艺术学院,音乐舞蹈学,2013,硕士.
[21]付建川.基于家庭属性和NL模型的学生出行行为及对策研究[D].长安大学,交通工程,2014,硕士.
[22]白璐.黑龙江省农村居民消费结构问题研究[D].东北农业大学,农业推广(专业学位),2013,硕士.
[23]甘剑.入侵检测系统的分析研究[J].武警工程学院学报,2004,02:77-80.
[24]胡吉兴.基于矢量量化的近邻查询研究[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[25]曹世运.基于准公共物品理论的政府公共医疗卫生服务研究[D].湖南师范大学,行政管理,2013,硕士.
[26]范艺娟.骨髓间充质干细胞对不同线性增加的流体剪应力的响应[D].重庆大学,生物学,2014,硕士.
[27]谢义灵.番茄内生细菌种群和数量动态分析及对番茄青枯病菌的拮抗作用研究[D].广西大学,植物病理学,2004,硕士.
[28]郭露.基于利益相关者理论的企业社会责任研究[D].中南民族大学,西方经济学,2013,硕士.
[29]吴微,苑玮琦,林森,宋辉,张洪涛.手掌静脉识别中感兴趣区域的选择与定位研究[J].光电子.激光,2013,01:152-160.
[30]李明敏.目标区域测序在新生儿和不典型1型糖尿病遗传基础研究中的应用[D].北京协和医学院,临床医学,2014,博士.
[31]陆鹿.广西十万大山盆地晚三叠世至早侏罗世沉积环境与古地理研究[D].中国矿业大学,矿产普查与勘探,2014,硕士.
[32]E.Corvee,S.Velastin,G.A.Jones.综合多种预测方案实现遮挡情况下的目标跟踪(英文)[J].自动化学报,2003,03:356-369.
[33]曹文辉.面向智能电网的配网重构研究[D].华东交通大学,电力系统及其自动化,2013,硕士.
[34]郭海洋.GPS网平差应注意的几个问题[J].石油地球物理勘探,2003,01:95-101+119-112.
[35]黄海滨,杨路明,王建新,李绍华.基于复合参数的蛋白质网络关键节点识别技术[J].自动化学报,2008,11:1388-1395.
[36]杜黎明.工艺参数对BH-HSS钢组织和性能的影响[D].东北大学,材料工程,2010,硕士.
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[38]王一夫.论技术异化及其消解路径[D].沈阳师范大学,科学技术哲学,2013,硕士.
[39]盛泽虎.司法错案的认定标准研究[D].中国政法大学,逻辑学,2014,硕士.
[40]刘亚玲.国际商事仲裁第三人制度探析[D].华东政法学院,国际法学,2003,硕士.
[41]何玉玲.基于生态理念的街道景观改造设计方法研究[D].长安大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[42]黄政民.欧洲当代城市住区形态与设计策略研究[D].中国建筑设计研究院,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[43]张顺友,马玉春.纵横双向行驶蜂窝梁龙门行车研制[J].重庆建筑.2004(03)
[44]王登峰.低低卫卫跟踪星间微波测距技术研究[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
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[48]徐卫星.X80管线钢性能检验分析研究[D].东北大学,材料工程,2010,硕士.
[49]文夏清.基于FPGA的超声成像前端系统研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[50]童锦.我国上市公司审计委员会制度问题探析[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.

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