Intermedin在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制研究

【摘要】研究背景最近几年来糖尿病的发病率每年均呈现上升，而且是心血管疾病的等位征。许多的研究表明：与非糖尿病患者相比，糖尿病患者对心肌的缺血再灌注损伤具有更高的敏感性，更容易导致严重而致命的心肌梗塞和心脏功能衰竭。中叶素（IntermedinIMD）是2004年发现的一种新的降钙素基因相关肽（CGRP），其结构类似于CGRP和肾上腺髓质素，属小分子活性多肽，是超家族成员之一，它主要是通过CGRP家族共同受体系统-降钙素样受体（CL）/受体活性修饰蛋白（RAMPs）复合物发挥其效应。并且，许多研究也表明IMD对心血管疾病具有明显的保护作用。但是至今IMD对于心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制，尤其是在合并有糖尿病的患者的心肌缺血再灌注损伤中的作用仍不清楚。因此，更进一步深入研究IMD对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用和机制具有较大的理论和实用价值。本研究以I型糖尿病大鼠模型为研究对象，运用分子生物学及细胞生物学手段，观察IMD对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中病理生理方面的影响，从而进一步揭示IMD对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制。本研究分为动物实验（在体实验）和细胞培养（体外实验）两个部分。第一部分Intermedin在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制研究本部分实验分为三章：第一章Intermedin对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌氧化应激的影响目的：观察IMD对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤氧化应激方面的影响，并尽可能地探讨其作用机制。方法：健康雄性SD(Spraguedawley)大鼠74只，220～250g。给予适应性饲养一周后，将74只雄性SD大鼠随机分为糖尿病组（50只）和非糖尿病组（24只）。非糖尿病组给予枸橼酸缓冲液腹腔注射，糖尿病组建立糖尿病大鼠模型，通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，其浓度为0.1mmol/L，以枸橼酸钠一枸橼酸缓冲液(PH=4.2)溶解STZ，按照55mg/kg剂量进行注射。阻断大鼠左冠状动脉前降支30min，再灌120min制备心肌缺血再灌注损伤模型。造模成功3周后，随机分为五组，分别为：假手术组(NS)、缺血再灌注(NIR)、糖尿病假手术组（DS）、糖尿病缺血再灌注组(DIR)、IMD处理组（IMD组），每组各12只。观察血糖、体重及一般状态的变化；应用化学法测定血清中肌酸激酶同功酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性；比色法测定心肌组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活性，以及心肌组织中一氧化氮合酶（NOS）和一氧化氮（NO）的含量；荧光定量PCR法检测心肌组织中P22等mRNA的表达。结果：1.注射STZ后糖尿病组大鼠的血糖明显升高，较其基础值和非糖尿病组升高有统计学意义（P＜0.05)，与其基础值和非糖尿病组体重相比则呈现明显的降低(P＜0.05或P＜0.01)。非糖尿病组大鼠可以观察到对外界反应灵敏，皮毛整洁并具有光泽，饮食饮水量正常；糖尿病组大鼠则表现为对外界反应相对迟钝，皮毛脏乱且无光泽，饮食饮水尿量均明显增多。2.无论糖尿病组还是非糖尿病组在缺血再灌注后，即在NIR组和DIR组中均观察到血清中的LDH、CK-MB活性以及心肌组织MDA含量均明显高于各自的对照组NS组和DS组；心肌组织中的SOD、NOS、NO活性则分别明显低于NS组和DS组(P＜0.05)。IMD组与DIR组相比较，心肌组织中SOD活性明显升高，而血清中的CK-MB、LDH活性以及心肌组织中的MDA含量均呈现明显地降低(P＜0.05)。3.NIR和DIR组心肌组织中p22等mRNA的表达量明显高于各自对照组NS和DS组，且差异均显著(P＜0.05)；IMD组心肌组织p22等mRNA的表达水平较DIR组则显著下降(P＜0.05)。第二章Intermedin对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响目的：观察IMD对糖尿病大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：I型糖尿病模型的建立及分组同第一章。分别观察光镜下心肌细胞的形态变化；以及进行电镜观察心脏超微结构；TUNEL法检测心肌细胞的凋亡率；Western-blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表达量。结果：1.光镜下可观察到缺血再灌注后，即NIR组和DIR组，心肌组织部分区域的心肌细胞呈现浊肿状态，心肌纤维横纹变得不清或消失，同时存在细胞核的裂解和消失；糖尿病组即DIR组上述的变化更趋于严重。但是IMD组心肌细胞变性坏死的程度较DIR组明显减轻。2.电镜下可见：NIR组和DIR组心肌细胞结构的不清晰，肌原纤维排列紊乱，稀疏，部分肌原纤维断裂，溶解，形成溶解灶；线粒体增生，水肿，大小不一，并伴有肿胀的线粒体成空泡样。IMD组与DIR组比较心肌组织的超微结构特别是线粒体损伤明显减轻。3.NIR组和DIR组的心肌细胞凋亡率分别明显高于相应的对照组，即NS组和DS组(P＜0.05)；IMD组心肌细胞凋亡率则较NIR组明显减少(P＜0.05)，可见IMD显著抑制了大鼠心肌细胞的凋亡。4.NIR组和DIR组的Caspase-3和Bax的蛋白表达量均比其各自对照组NS组和DS组显著增加(P＜0.05)。IMD组同DIR组相比心肌组织caspase-3和Bax的蛋白表达量则明显降低，并具有统计学意义(P＜0.05)。与NS与DS组分别比较，心肌组织的Bcl-2蛋白的表达在NIR组和DIR组明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。IMD组与DIR组比较，IMD组Bcl-2蛋白表达明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。第三章Intermedin对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注炎性细胞因子的影响目的：观察IMD对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后炎性细胞因子的影响，从而进一步探讨IMD对糖尿病心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制。方法：糖尿病模型的建立及分组同第一章。应用ELISA法测定血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。应用RT-PCR法检测心肌组织中TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA的表达。免疫组织化学S-P法和Western-blot检测心肌组织NF-κB的表达。结果：1.与各自对照组NS组和DS组相比较，NIR组与DIR组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量升高(P＜0.05)。但是同DIR组比较，IMD组大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量则明显降低。(P＜0.05)。2.NIR组和DIR组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达与各自对照组NS组和DS组比较均明显增强(P＜0.05)。IMD组TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达比DIR组明显减弱(P＜0.05)。3.免疫组织化学结果显示，当心肌缺血再灌注后其心肌组织中可观察到核移位的现象，即在NIR组和DIR组中NF-κB活化增强，阳性颗粒出现在胞浆和胞核。而在NS组和DS组大鼠心肌组织中观察到NF-κB呈低表达状态，并且阳性表达出现在胞浆中。同DIR组相比较，IMD组NF-κB的表达活性将低，阳性表达的细胞数明显减少(P＜0.05)。4.WesternBlot结果显示：分别与NS组和DS组相比较，NIR组和DIR组NF-κB表达量均显著增加(P＜0.05)，而IMD组NF-κB表达显著低于DIR组(P＜0.05)。第二部分Intermedin对高糖孵育H9c2细胞缺氧—复氧性损伤的保护作用第一章Intermedin（IMD）真核表达质粒的构建及鉴定目的：构建能在真核细胞中表达Intermedin基因的载体pIRES2-EGFP，导入大鼠H9c2心肌细胞，并观察pIRES2-EGFP/IMD质粒在H9c2细胞中的表达，为进一步实验奠定基础。方法：首先人工合成大鼠IMD的CDS区全长，然后与pMD19-TSimple载体连接，构建pIRES2-EGFP/IMD重组质粒，通过酶切电泳和DNA测序进行鉴定。将重组质粒用Lipofectamine2000转染至大鼠H9c2细胞，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光及流式细胞术检测转染效率，选定最优转染条件；RT-PCR及Western-blot检测转染后IMDmRNA及蛋白的表达。结果：1.测序和酶切鉴定表明成功构建了pIRES2-EGFP/IMD质粒。2.荧光显微镜及流式细胞术检测当质粒：Lipofectamine2000为3:7.5配比的转染复合体时转染效率最高。3.RT-PCR及Western-blot结果显示，转重组质粒组IMDmRNA表达量较未转染组增高（P＜0.01），蛋白表达也显著增高（P＜0.01）。第二章IMD对高糖孵育H9c2细胞缺氧-复氧损伤的影响及机制目的：本研究通过在体外细胞水平利用化学缺氧法形成缺氧条件，从而建立高糖孵育下的H9c2大鼠心肌细胞的缺氧-复氧损伤模型，初步探讨IMD对高糖孵育下H9c2心肌细胞缺氧复氧损伤是否具有保护作用及作用的可能分子机制。方法：将H9c2心肌细胞分为5组：①正常糖对照组（control组），②高糖对照组（HG组），③高糖缺氧复氧组（SI/R组），④高糖IMD质粒组（IMD组），⑤阻断剂组（PD组）：即S/R+IMD质粒+PD98059。利用MTT比色法测定细胞的活力，然后分别检测细胞培养液上清中LDH、SOD和MDA的水平，流式细胞仪检测细胞凋亡率，Western-blot方法检测磷酸化ERK1/2的蛋白的表达。结果：1.各组间的差异均具有显著统计学意义(P＜0.05)。缺氧复氧后细胞活力较HG组降低(P＜0.05)；而IMD转染细胞后，其细胞活力较SI/R组显著增高（P＜0.05)；与control组比较：心肌细胞经高糖孵育后其活力显著下降(P＜0.05)；加入ERK1/2抑制剂PD98059的PD组与IMD组相比细胞活力下降（P＜0.05）。2.各组间LDH活性和MDA含量差异具有统计学意义(P＜0.05)。HG组与control组比较：心肌细胞经高糖孵育后，其细胞LDH释放量和MDA含量较control组显著增多(P＜0.05)。缺氧复氧后上述指标较HG组显著增加（P＜0.05)；IMD转染细胞后，其活性较SI/R组显著减少（P＜0.05)；加入ERK1/2抑制剂PD98059使细胞培养液中上述指标较SI/R组显著提高(P＜0.05)。3.各组间细胞凋亡率差异具有统计学意义。与control组相比，HG组细胞凋亡率明显增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05）；缺氧复氧后细胞凋亡率与HG组比较明显增加（P＜0.05）；加入PD98059后与IMD组比较细胞凋亡率提高(P＜0.05)。4.Westernblot检测显示：与control组比较：心肌细胞经高糖孵育后，其pERK1/2蛋白表达较control组显著增多（P＜0.05)；SI/R组与HG组、IMD组差异均具有统计学意义(P＜0.05)。加入ERK1/2抑制剂PD98059后的PD组，pERK1/2蛋白的表达被明显抑制(P＜0.05)。结论：本实验研究提出并证实了，糖尿病加重心肌缺血再灌注损伤，IMD可通过抗氧化应激，抑制细胞凋亡和减轻炎症反应，发挥对高糖环境下心肌缺血再灌注损伤的保护作用，其作用机制可能与ERK1/2细胞信号通路有关。
【作者】李虹；
【导师】肖传实；
【作者基本信息】山西医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】中叶素；缺血再灌注损伤；糖尿病；

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