ISEcpl介导志贺菌耐药的分子基础研究

【摘要】志贺菌属细菌又称痢疾杆菌,是细菌性痢疾(简称菌痢)的病原体。菌痢是全球都存在的一个公共卫生问题,尤其对发展中国家造成重大危害。志贺菌属根据O抗原分为4个群：分别为痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内志贺菌。随着人们对各种抗生素持续广泛的应用,甚至滥用,使志贺菌耐药现象愈发严重,不但影响临床疗效,而且严重增加治疗成本和新药研发成本,并使新药应用于临床的周期缩短。因此,研究志贺菌耐药机制,进而为志贺菌耐药的防治提供科学依据和有效手段,已成为目前的研究热点。插入序列(IS)是可以独立存在的遗传单元,是染色体的特殊组成部分,可以从染色体上的一个位置转移到另一个位置,或在不同染色体间跳跃。最近有学者报道,ISEcpl可能与细菌β-内酰胺类抗生素耐药有关。目的本课题通过药物诱导、基因测序等手段,比较志贺菌敏感株诱导前后ISEcpl与blaCTX-M的位置关系及blaCTX-M的表达的变化,以阐明ISEcp1诱导转座影响细菌耐药的分子机制。并进一步收集志贺菌株进行ISEcp1、blaCTX-M的分布、头孢菌素耐药情况及二者对应关系的分析,从而对所阐明的机制提供现场佐证。方法1.志贺菌的收集、鉴定：从河南、江西收集志贺菌233株,并进行血清、生化鉴定；2.药敏试验：用纸片扩散法测定菌株对所研究抗生素药敏纸片的抑菌环,用琼脂稀释法测定菌株的最低抑菌浓度；3.头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验：采用改良K-B法筛选临床分离、鉴定的志贺菌敏感株,用琼脂稀释法测定志贺菌敏感株对头孢噻吩的最低抑菌浓度,采用头孢噻吩次抑菌浓度诱导实验构建志贺菌诱导耐药株；4.全基因组测序分析比较志贺菌敏感株诱导前后差异：Solexa全基因组测序,并利用Clustal等生物学软件进行比较、分析；5.ISEcpl转座及对blaCTX-M表达的影响：通过PCR、克隆和测序分析比较诱导前后ISEcpl与blaCTX-M的位置关系；并将克隆构建质粒转化入感受态细胞DH5α,K-B琼脂法对不同转化子进行药敏试验及超广谱p-内酰胺酶表型确证试验,同时做RT-PCR,阐明ISEcpl诱导转座后对blaCTX-M的表达的影响；6.ISEcpl与blaCTX-M的分布及菌株耐药情况：PCR检测所收集志贺菌的ISEcpl与blaCTX-M,K-B实验进行头孢菌素耐药性检测,将耐药情况与所检测目的基因进行对应分析。结果1.对志贺菌敏感株mel-sf1998023/zz进行头孢噻吩次抑菌浓度诱导,最终得到诱导后头孢噻吩MIC为512mg/L,是诱导前出发菌株的32倍。2.头孢噻吩诱导志贺菌敏感株mel-sf1998023/zz的前后,不但对头孢噻吩的耐药性发生了改变,同时测得诱导后菌株对头孢唑啉、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢毗肟均由敏感转变为耐药。3.头孢噻吩诱导志贺菌敏感株使其耐药后,基因组序列发生了改变,不但有SNV,还造成了新的插入和缺失,且诱导前后菌株插入序列的拷贝数发生了变化。4.通过比较志贺菌出发敏感株与诱导耐药株的KEGG代谢通路发现诱导耐药株比出发敏感株多一个代谢通路ko00930:Caprolactamdegradation,即己内酰胺代谢通路。5.志贺菌被头孢噻吩诱导后,ISEcpl转座插入到blaCTX-M上游,且诱导后的志贺菌较诱导前对多种头孢菌素耐药水平显著提高。6.成功获得重组质粒pCTX、pISECTX,并将它们与pMD19-T空载体分别转入DH5α感受态细胞,获得DH5α(pCTX)、DH5α(pISECTX)、DH5α(T)转化子。对DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)插入序列测序发现该blaCTX-M基因为blaCTX-M-55,其上游是ISEcpl含-35区和-10区启动子位点。7.DH5α(pISECTX)克隆株blaCTX-M基因表达的相对含量显著高于DH5α(pCTX)的相对含量。8.DH5α(pISECTX)较DH5α(pCTX)对下列头孢菌素均从不耐药到耐药,包括头孢噻吩、头孢呋辛钠、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松,对头孢吡肟虽没达到耐药水平,但DH5α(pISECTX)较DH5α(pCTX)对头孢吡肟的最低抑菌浓度提高了32倍。9.对DH5α(T)、DH5α(pCTX)及DH5α(pISECTX)进行ESBLs表型确证试验,判定只有DH5α(pISECTX)产ESBLs。10.233株志贺菌株中,对头孢噻吩、头孢唑啉耐药检出率较高分别为35.2%和28.3%,对头孢呋辛钠耐药检出率为13.7%,对抗生素头孢噻肟的耐药检出率12.9%高于头孢他啶9.0%,对头孢吡肟的耐药检出率最低,为5.2%。共有92株对1种或1种以上头孢菌素产生耐药。志贺菌耐药谱型分析显示,志贺菌对6种头孢菌素的耐药谱型有24种。最常见的头孢菌素耐药谱型是头孢噻吩、头孢唑啉占35.87%。11.1998～2001年及2003～2008年志贺菌头孢呋辛钠、头孢噻肟的耐药检出率有逐年上升的趋势。同时期,志贺菌ISEcp1和blaCTX-M的携带率也有逐年上升的趋势。12.志贺菌中基因标记分布情况：1)ISEcp1阳性组志贺菌对头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于ISEcp1阴性组志贺菌。2)blaCTX-M阳性组志贺菌对头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于blaCTX-M阴性组志贺菌。3)ISECTX片段阳性组志贺菌对头孢噻吩、头孢唑啉、头孢呋辛钠及头孢噻肟的耐药检出率高于ISECTX片段阴性组志贺菌。结论1.在持续的小剂量头孢噻吩药物的作用下,志贺菌对头孢菌素类抗生素的敏感性能大大降低,甚至产生严重耐药。2.头孢噻吩诱导敏感志贺菌前后基因组序列发生改变,且诱导耐药株比出发敏感株多一个己内酰胺代谢通路,此代谢通路可能与诱导耐药有关。3.在外界头孢菌素压力下,ISEcp1可转座插入到blaCTX-M上游,为blaCTX-M表达提供所需要的启动子,使其高表达导致细菌对各种头孢菌素耐药。4.1998～2001年及2003～2008年志贺菌头孢呋辛钠、头孢噻肟的耐药检出率逐年上升的同时伴有ISEcp1和blaCTX-M的携带率逐年上升。5.ISEcpl和blaCTX-M与头孢菌素耐药有关,且若ISEcpl位于blaCTX-M上游头孢菌素耐药检出率较高。
【作者】王颖芳；
【导师】段广才；
【作者基本信息】郑州大学，流行病与卫生统计学，2013，博士
【关键词】志贺菌；ISEcp1；blaCTX-M；耐药；诱导；全基因组测序；

【参考文献】
[1]李彩薇.论马克思社会进步的双重评价尺度及其在当代的发展[D].延安大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[2]马栋.深埋岩溶对隧道安全影响分析及处治技术研究[D].北京交通大学,2012.
[3]庞威.建平县行政权力效应评价与改进研究[D].吉林大学,工业工程,2013,硕士.
[4]曹艳梅,夏禾.运行列车对高层建筑结构的振动影响[J].工程力学,2006,03:162-167.
[5]傅蔚聪.全膝关节置换术后早期引流管夹闭的临床研究[D].山东大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[6]于萌萌.宽带卫星通信系统OFDM同步技术的研究[D].吉林大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[7]陈茜茜.有限维Hilbert空间上的椭圆框架[D].南京航空航天大学,基础数学,2014,硕士.
[8]王宇洋.我国餐饮业服务人员思想政治教育研究[D].东北农业大学,思想政治教育,2013,硕士.
[9]陈笑梅,付云虹.基于Essbase的商业智能实例产品开发[J].计算技术与自动化,2001,04:71-74.
[10]蔡玉贤.吉林省人口职业结构特征与空间分布演变研究[D].吉林大学,人口学,2013,硕士.
[11]张金强,曲寿利,孙建国,董宁,于文琴.一种碳酸盐岩储层中流体替换的实现方法[J].石油地球物理勘探,2010,03:406-409+422+472+316.
[12]管荣春.三联集团管理模式改革研究[D].大连理工大学,工商管理,2003,硕士.
[13]张建.聚合物基石墨烯纳米复合材料的研究进展[J].化工新型材料,2012,08:8-10.
[14]王云峰.型钢混凝土L形截面短肢剪力墙受力性能研究[D].西安科技大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[15]王海丹.基于Mesh网络井下导航系统的设计与实现[D].北京交通大学,2014.
[16]任瑞静.排序集抽样下中位数的估计[D].华中师范大学,概率论与数理统计,2014,硕士.
[17]汪婧.郁达夫自叙传小说探究[D].安徽大学,汉语言文字学,2012,硕士.
[18]孙佳林.基于Curvelet变换的地层吸收补偿方法研究[D].吉林大学,地球探测与信息技术,2013,硕士.
[19]魏东霞.在中学阶段开展智能机器人教学研究[D].河北师范大学,现代教育技术,2013,硕士.
[20]佘春东,范植华,孙世新,胡四泉,车著明.一种基于投影树的并行序列挖掘算法[J].计算机工程与应用,2004,14:4-5+56.
[21]徐明亮,须文波.自适应RBF网络Q学习控制[J].控制与决策,2010,02:303-306.
[22]李彪,徐大海,曾晖.边缘重构对锯齿型石墨烯纳米带电子输运的影响[J].物理学报,2014,11:258-263.
[23]高迎春.大肠埃希菌micC启动子相关性研究[D].福建医科大学,临床检验诊断学,2014,硕士.
[24]李晓锐.GEO SAR干涉/差分干涉系统分析与仿真验证[D].北京理工大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[25]蔡晓嘉.低千伏管电压低浓度造影剂肺动脉造影联合迭代重建对肺拴塞检测能力的探讨[D].河北医科大学,影像医学与核医学（专业学位）,2014,硕士.
[26]刘镡璞.基于GEOSLOPE的晓街河水库坝体渗流稳定分析[D].大连理工大学,水利工程（专业学位）,2013,硕士.
[27]孙现辉.西天山南段柳树沟铜矿地质特征与成因分析[D].西北师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[28]展敏.起重船吊物系统的控制研究[D].江苏科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[29]亓常松,孙吉贵,于海鸿.基于离散度的决策树构造方法[J].控制与决策,2008,01:51-55.
[30]陈俊生.复杂条件地震方法座谈会述评[J].石油地球物理勘探,1986,05:540-543.
[31]齐高峰.加拿大博士生教育的历史考察与启示[D].广西师范大学,高等教育学,2014,硕士.
[32]王惠.幼儿教师情绪调节方式与工作倦怠的关系研究[D].郑州大学,应用心理学,2013,硕士.
[33]侯正巍.杭州经济技术开发区产业创新发展模式研究[D].浙江工业大学,2012.
[34]唐紫莹.青少年对网络暴力行为的责任归因研究[D].南京师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[35]张春鹏.全液压自动猫道举升系统研究[D].吉林大学,机械电子工程,2014,硕士.
[36]卢亚辉.工作流系统的访问控制模型及其安全性分析的研究[D].清华大学,2008.
[37]徐思思.城市居民对于流动人口的选择性接纳研究[D].东北师范大学,社会学,2012,硕士.
[38]陈峰.皖北B市违法建设治理对策研究[D].安徽大学,公共管理,2014,硕士.
[39]刘变叶,宁一博.纾解中小企业融资瓶颈的创业投资发展模式研究[J].产业经济评论,2015,02:64-71.
[40]黄开达.基于VRS技术的外弹道精密测量系统研究[J].舰船电子工程,2014,03:150-152.
[41]阳昊.内镜经鼻入路至岩斜区的解剖研究及Meckel腔的应用解剖研究[D].第四军医大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[42]范雅卓.社区党组织在社区文化建设中的作用研究[D].大连理工大学,公共管理,2013,硕士.
[43]齐广学,刘彬.冷拔钢棒分钢仪[J].冶金自动化,1988,04:52-54.
[44]智渊.酸碱修饰柠檬果胶的中性糖结构分析及抑制半乳凝素-3活性的研究[D].东北师范大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[45]孙若晗.合同管理系统与实现[D].复旦大学,软件工程,2012,硕士.
[46]张晶波.企业伦理规范化构建研究[D].中国社会科学院研究生院,战略管理（专业学位）,2014,硕士.
[47]EvadneCowell.信息通信技术政策在中国和牙买加小学中实施情况的对比分析[D].东北师范大学,教育技术学,2012,硕士.
[48]陈齐.基于PCI的1553B通讯扩展板的设计与实现[D].西北工业大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[49]张月蓉.基于混合推荐的电影推荐系统的研究与实现[D].安徽大学,计算机技术,2013,硕士.
[50]郑代靖.饱和砂土地层盾构隧道的地震动力响应分析[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.