Wnt1-cre条件性敲除Sox10基因对小鼠内耳螺旋神经节发育的影响及相关机制

【摘要】第一部分Sox10而非MMP-24调节小鼠胚胎时期内耳螺旋神经节的迁移研究目的：哺乳动物听觉系统的发育受到内在基因和外在环境共同影响,是造成新生儿先天性耳聋的重要因素。内耳不同结构来自不同的干细胞它们分别迁移分化发育,然后连接成为有机的整体,发挥信息传递功能。与大部分来源于神经嵴细胞的外周感觉神经元不同,耳蜗螺旋神经节的神经元细胞同耳感觉上皮等耳蜗结构起源于耳基板,其外周包绕的施万细胞则是神经嵴细胞分化而来。在小鼠内耳发育过程中,螺旋神经节前体细胞经历了从耳基板穿过基底膜最终到达Resenthal’s小管的迁移过程,然后发出神经纤维支配柯蒂氏器的内外毛细胞目前我们对于耳蜗螺旋神经的发生发育过程中的确切基因及分子机制仍知之甚少。已证实Sox10基因对神经嵴细胞的分化发育起关键作用,缺失可导致神经性耳聋等联合症状为特征的瓦登伯格综合征(WS,WaardenburgSyndrome)。文献显示,基质金属蛋白酶(MMPs)对于细胞外基质(ECMs)的蛋白水解重构,肿瘤的转移,胚胎发育,神经再生有重要作用,其中MMP-24被发现表达于神经元细胞中,其是否在内耳神经元迁移过程中参与基底膜的降解,以及是否受到Sox10基因缺失影响从而引起内耳发育异常尚未有相关研究报道。实验方法：获得MMP-24-/-和Wntl-cre;Sox10f/f基因敲除小鼠,对小鼠进行多聚甲醛心脏灌注并解剖。制作MMP-24和Sox10RNA探针并进行全组织原位杂交。环氧树脂包埋,切片。亲脂性荧光染料示踪外周和中枢神经走行。实验结果：nRNA原位杂交技术显示MMP-24大量表达于胚胎早期在内耳迁移的神经元中。随后用MMP-24标记神经元,用Sox10标记神经嵴分化细胞,发现在Wntl-cre;Sox10基因敲除小鼠中神经嵴细胞来源的外周感觉神经元数量明显减少而耳基板来源的耳蜗前庭神经元未见减少。同时,我们发现Sox10的表达缺失虽不能显著影响螺旋神经节的存活,但可以导致其过度迁移至异常位置。进一步应用亲脂性神经染料示踪技术标记螺旋神经节的传出神经和后脑耳蜗核的中枢支配,发现在生后一天MMP-24基因敲除小鼠中,螺旋神经节的外周和中枢神经纤维与正常组无异。研究结论：以上结果说明虽然MMP-24可以标记胚胎早期迁移的螺旋神经节的神经元,但其对于胚胎早期螺旋神经元的迁移和神经纤维和发育都不是必须的,可能有其他功能相似的基因与MMP-24协同产生作用。Sox10基因敲除可能导致包绕螺旋神经的施万细胞缺失,从而引起神经元的迁移异常。第二部分Wnt1-cre性敲除Sox10基因导致小鼠内耳螺旋神经节迁移和支配异常研究目的：耳蜗螺旋神经节的神经元细胞同耳感觉上皮等耳蜗其他结构起源于耳基板,其外周包绕的施万细胞则是神经嵴细胞分化而来。研究发现,ErbB2基因敲除导致小鼠内耳施万细胞缺失后其螺旋神经节迁移位置异常,发出的神经纤维杂乱稀疏,但仍能支配外周和中枢相应区域。由于ErbB2在内耳不仅表达于施万细胞还表达于支持细胞,因此并不能明确区分是哪种细胞对神经元神经纤维提供了导向作用。在前期实验中我们用神经嵴细胞特异性的Wntl-cre条件性敲除转录因子Sox10,以期消除神经嵴细胞源性细胞内Sox10基因的表达,而不影响基板源性细胞内Sox10的表达。建立了一种新的模型可用来评估仅仅施万细胞缺失对于内耳神经支配的影响。实验方法：获得Wntl-cre;Sox10f/f基因敲除小鼠并检测基因型。对小鼠进行多聚甲醛心脏灌注并解剖耳蜗。使用P75NTR和NT-3RNA探针进行全耳蜗原位杂交。环氧树脂包埋,切片,Stevenel’sBlue染色。用不同抗体进行免疫组织荧光化学检测：MyoVII抗体标记毛细胞,Neurofilament标记传出神经,Tubulin标记传入神经,Caspase3和PSVue标记凋亡细胞,Hoechst标记细胞核。亲脂性荧光染料示踪外周和中枢神经纤维走行。实验结果：Sox10基因敲除导致内耳施万细胞缺失,引起螺旋神经节细胞迁移越过Rosenthal小管到达蜗轴,甚至有些神经元沿蜗轴迁移出内耳,到达内耳门位置。我们测量了5对E18.5的小鼠内耳螺旋神经节细胞到耳蜗内侧壁的距离(图2)。发现在耳蜗中段螺旋神经节细胞到耳蜗内侧壁的距离,Sox10基因突变组(Mean=125μm;St.Dev=28;N=5)是正常组(Mean=34μm;St.Dev=14;N=5)的4倍,差异有统计学意义(ANOVA,P<0.05)。可见施万细胞的缺失导致螺旋神经节细胞明显的过度迁移。在Sox10基因敲除小鼠内耳中,螺旋神经元可以发出纤维到达毛细胞支配Corti器,但是还有许多传入神经越过Corti器到达耳蜗的外侧壁。值得注意的是,由螺旋神经元发出至中枢耳蜗核的神经纤维与正常并无差别。与ErbB2基因敲除小鼠内耳相比,条件性基因敲除Sox10螺旋神经节内神经元的凋亡数量有限,且神经营养因子NT-3表达正常。说明单施万细胞的缺失对于胚胎时期神经元的发生和存活作用不大。研究结论：以上数据表明,神经嵴细胞来源的施万细胞对于内耳听觉神经元的中枢分布和部分外周的神经纤维不是必需的。施万细胞的缺失不能直接引起螺旋神经节的凋亡,但施万细胞为迁移的螺旋神经节细胞提供终止信号,同时引导传入神经延伸并准确定位于Corti器。Sox10可能通过ErbB2调节施万细胞的分化和存活。
【作者】毛彦妍；
【导师】王海波；
【作者基本信息】山东大学，耳鼻咽喉科学，2014，博士
【关键词】螺旋神经节；感觉神经元；胶质细胞；MMP-24；Sox10；内耳神经节；神经纤维导向；施万细胞；神经营养因子；细胞迁移；神经靶向支配；

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