miR-19b靶向调控巨噬细胞ABCA1对apoE~(-/-)鼠动脉粥样硬化的影响

【摘要】动脉粥样硬化性疾病在全球罹患率与致死率均名列前茅，严重危害人类健康。其早期病变的标志性特征为血管内皮下大量巨噬细胞内脂质蓄积和泡沫细胞的形成。泡沫细胞最终坏死崩解释放出胞内的胆固醇，构成动脉粥样硬化斑块的主要成分，进一步促进动脉粥样硬化的进展。因此，促进巨噬细胞内胆固醇流出及体内胆固醇逆向转运(reversecholesteroltransport，RCT)，从而抑制泡沫细胞形成和血管壁内脂质沉积对动脉粥样硬化性疾病的防治具有重要意义。三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATPbindingcassettetransporterA1，ABCA1)为膜整合蛋白，以ATP为能源将胞内游离胆固醇和磷脂转运到胞膜，最终与附在细胞表面的载脂蛋白AI(apoproteinAI，apoAI)结合。这一过程为高密度脂蛋白（highdensitylipoprotein，HDL）生成所必需，也是促进巨噬细胞内过量胆固醇流出及RCT的关键步骤。ABCA1在巨噬细胞中的表达和活性受到转录和转录后水平的严密调控。microRNA是一类内生性的、长约22个碱基的小分子RNA，在转录后水平调控基因表达。microRNA通过碱基互补配对与靶基因的3’非翻译区（3’untranslatedregion，3’UTR）结合，从而导致靶基因mRNA降解和翻译抑制。文献报道miR-19b与胞内脂质代谢密切相关。高脂饮食可诱导miR-19b表达上调，在人主动脉粥样硬化斑块及腹主动脉瘤中检测到miR-19b高表达，提示miR-19b在动脉粥样硬化发生发展中发挥重要作用，但miR-19b致动脉粥样硬化的相关作用机制尚不清楚。为了探讨miR-19b致动脉粥样硬化的相关作用机制，前期采用生物信息学预测miR-19b的靶基因，发现miR-19b恰好具有靶向调控ABCA1的生物学理论基础。据此设想，miR-19b靶向作用巨噬细胞ABCA1的表达，抑制胞内胆固醇流出和RCT，促进胞内脂质蓄积和血管壁脂质沉积，从而导致动脉粥样硬化的发生发展。为了验证miR-19b致动脉粥样硬化机制的这一假说，我们首先在第一部分实验中对miR-19b靶向作用ABCA1进行了深入的生物信息学分析，并用荧光素酶报告基因验证了miR-19b结合ABCA13’UTR，然后，在第二部分实验中我们研究了miR-19b对巨噬细胞ABCA1表达、胞内胆固醇流出及脂质含量的影响，接着，在第三部分实验中，我们观察了miR-19b对apoE-/-小鼠的RCT、血脂水平及动脉粥样硬化病变的影响，最后，在第四部分实验中，我们观察了具有明显调脂作用的薯蓣皂苷元（Diosgenin，Dgn）对巨噬细胞miR-19b水平、ABCA1表达、脂质代谢及apoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响，探讨了Dgn通过抑制miR-19b抗动脉粥样硬化的作用机制。本研究揭示了miR-19b在动脉粥样硬化发生发展的作用及其机制，为动脉粥样硬化性疾病的防治提供新的干预靶点。第一部分miR-19b靶基因的预测及其与巨噬细胞ABCA13’UTR的靶向作用目的：预测miR-19b与靶基因ABCA1的靶向结合及结合位点和自由能情况，在细胞水平验证miR-19b是否与ABCA13’UTR靶向结合。方法：从miRNAbase数据库获取成熟的miR-19b序列，从GeneBank查询ABCA13’UTR序列。利用miRDB、miRanda、miRNAViewer、TargetScan和RNAhybrid在线数据库预测分析人/鼠miR-19b与ABCA1的结合情况、结合位点及结合自由能情况。根据预测结果，用PCR方法扩增人THP-1巨噬细胞ABCA13’UTR，构建野生型psiCHECK-2-ABCA1-WT3’UTR、突变型psiCHECK-2-ABCA1-Mut3’UTR和miR-19bmimic共转染到293T细胞，检测荧光素酶报告基因的活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平变化。结果：在成功获取miR-19b成熟序列和ABCA13’UTR序列基础上，生物信息学分析发现人/鼠ABCA13’UTR中存在多个结合位点，miR-19b与ABCA1的结合评分较高，且二者结合的自由能较低。miR-19bmimic与野生型psiCHECK-2-ABCA1-WT3’UTR共转染后抑制荧光素酶活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平，与突变型psiCHECK-2-ABCA1-Mut3’UTR共转染后荧光素酶活性和ABCA13’UTR序列的mRNA水平无变化。结论：miR-19b具有靶向作用人/鼠ABCA1的生物信息学基础，能够结合人巨噬细胞ABCA13’UTR。第二部分miR-19b靶向沉默人/鼠巨噬细胞ABCA1表达对胆固醇流出的影响目的：观察对miR-19b对人/鼠巨噬细胞ABCA1蛋白及mRNA表达水平、胞内胆固醇流出和脂质含量的影响。方法：培养人THP-1巨噬细胞和小鼠腹腔巨噬细胞（mouseperitonealmacrophage，MPM），利用RiboFECTTMCP转染试剂，将miR-19bmimic或miR-19binhibitor转染到THP-1巨噬细胞/MPM中，实时荧光定量PCR和westernblot检测ABCA1mRNA和蛋白表达；液体闪烁计数测定荷脂THP-1巨噬细胞/MPM细胞内胆固醇流出情况，HPLC检测胞内脂质含量；油红O染色显示胞内脂滴情况。结果：转染miR-19bmimic的THP-1巨噬细胞/MPM中ABCA1mRNA和蛋白水平明显下调，胞内胆固醇流出减少，胞内总胆固醇（totalcholesterol，TC）、胆固醇酯（cholesterolester，CE）及游离胆固醇（freecholesterol，FC）的含量明显增加，胞内脂滴稠密且体积肥大，而转染miR-19binhibitor则刚好出现相反的结果。结论：（1）miR-19b具有靶向抑制THP-1巨噬细胞/MPM中ABCA1mRNA和蛋白表达的作用。（2）miR-19b具有调控THP-1巨噬细胞/MPM胆固醇流出的功能，其机制可能与靶向调控ABCA1有关。第三部分miR-19b对apoE-/-小鼠胆固醇逆向转运、动脉壁脂质沉积和粥样硬化病变的影响目的：探讨miR-19b对apoE-/-小鼠体内RCT、血脂水平、主动脉壁脂质沉积和粥样硬化病变的影响及机制。方法：高脂饮食（含15%猪油+0.25%胆固醇）喂养的45只apoE-/-小鼠，随机分为3组：高脂对照组、miR-19bagomir组、miR-19bantagomir组。液体闪烁计数测定MPM来源的RCT效率；酶氧化法检测甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（highdensitylipoproteincholesterol，HDL-c）和低密度脂蛋白胆固醇（lowdensitylipoproteincholesterol，LDL-c）等血脂水平；苏丹Ⅳ染色显示主动脉内膜的动脉粥样硬化病变情况；HE染色显示主动脉窦动脉粥样硬化病变情况；油红O染色观察主动脉窦处脂质沉积情况；Masson三色染色显示斑块中的胶原纤维；westernblot检测小鼠主动脉ABCA1蛋白表达。结果：转染miR-19bagomir明显抑制apoE-/-小鼠粪便中3H固醇的放射活性，降低血浆HDL-c水平，升高LDL-c水平，增加主动脉内膜的动脉粥样硬化病变面积，加剧主动脉窦处脂质沉积，降低斑块的稳定性，下调主动脉ABCA1蛋白表达。转染miR-19bantagomir则明显增加粪便中的固醇水平，改善血脂水平，抑制主动脉壁内脂质沉积和动脉粥样硬化病变的进展，上调ABCA1蛋白表达。结论：（1）miR-19b损害apoE-/-小鼠体内RCT，促进血管壁内的脂质沉积和动脉粥样硬化的进展。（2）miR-19b的致动脉粥样硬化效应可能与靶向抑制apoE-/-小鼠主动脉ABCA1表达有关。第四部分薯蓣皂苷元对miR-19b/ABCA1水平及apoE-/-小鼠主动脉病变的影响目的：观察薯蓣皂苷元（Diosgenin，Dgn）对THP-1巨噬细胞/MPM中miR-19b与ABCA1水平及其对apoE-/-小鼠体内RCT、血脂水平、主动脉壁粥样硬化病变的影响，从而探讨Dgn抗动脉粥样硬化的作用机制。方法：用Dgn处理并结合miR-19bmimic或inhibitor转染THP-1巨噬细胞/MPM后，实时荧光定量PCR检测miR-19b水平，westernblot检测ABCA1蛋白表达；液体闪烁计数测定荷脂THP-1巨噬细胞/MPM细胞内胆固醇流出情况，HPLC检测胞内脂质含量。将高脂饮食（含15%猪油+0.25%胆固醇）喂养的60只apoE-/-小鼠随机分为4组：高脂对照组、薯蓣皂苷元组、薯蓣皂苷元+miR-19bagomir组、薯蓣皂苷元+miR-19bantagomir组。液体闪烁计数测定MPM来源的RCT效率；酶氧化法检测TG、TC、HDL-c和LDL-c等血脂水平；HE染色显示主动脉窦动脉粥样硬化病变情况；油红O染色观察主动脉窦处脂质沉积情况；Masson三色染色显示斑块中的胶原纤维。结果：Dgn呈剂量和时间依赖性上调THP-1巨噬细胞/MPM中ABCA1蛋白表达，明显降低miR-19b水平，增加胞内胆固醇流出，减少胞内TC、CE及FC的含量。Dgn增加apoE-/-小鼠粪便中3H固醇的放射活性，升高血浆HDL-c水平，降低LDL-c水平，上调主动脉ABCA1表达，减少主动脉内膜的动脉粥样硬化病变面积，减轻主动脉窦处脂质沉积，增加斑块的稳定性。miR-19b拮抗Dgn的上述效应，抑制miR-19b则增强Dgn的上述效应。结论：（1）Dgn抗动脉粥样硬化作用与促进巨噬细胞内胆固醇流出和体内RCT的功能有关。（2）Dgn抗动脉粥样硬化的作用机制与下调miR-19b从而促进ABCA1表达有关。
【作者】吕运成；
【导师】唐朝克；
【作者基本信息】南华大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】miR-19b；三磷酸腺苷结合盒转运体A1；脂质蓄积；胆固醇逆向转运；动脉粥样硬化；

【参考文献】
[1]齐明阳.日光温室黄瓜CO_2施肥技术研究[D].河南科技大学,设施农业（专业学位）,2014,硕士.
[2]陈娜.中国民歌《茉莉花》之研究[D].河北师范大学,艺术,2014,硕士.
[3]赵萍.基于单级升压逆变器的光伏并网发电系统研究[D].南京航空航天大学,电力电子与电力传动,2013,硕士.
[4]俞秀莲,程晓卿,秦勇,邢宗义.基于可靠性的城轨车辆预防性维修优化模型[J].计算机仿真,2014,02:225-229.
[5]陈晶斌,徐家壮,庞欢,钟淦基,李忠明.等规聚丙烯在碳纳米填料网络中的受限结晶行为[A].中国化学会高分子学科委员会.2013年全国高分子学术论文报告会论文摘要集——主题N：高分子加工与成型[C].中国化学会高分子学科委员会:,2013:1.
[6]康艳荣.公共危机协同治理中的非政府组织参与研究[D].华中师范大学,中外政治制度,2014,硕士.
[7]齐建东,陶兰,孙总参.数据挖掘技术在入侵检测中的应用[J].计算机工程与应用,2004,06:158-161.
[8]李春华,刘春生,李海军,郑载满.焦炉集气管压力自寻优模糊控制系统的研制与应用[J].冶金自动化,1997,05:32-34.
[9]富童.基于车载自组织网络的广播算法研究与优化[D].大连理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[10]杨晓翠.关于初中数学课堂合作学习中教师作用的研究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[11]蒋天颖,孙伟.网络位置、技术学习与集群企业创新绩效——基于对绍兴纺织产业集群的实证考察[J].经济地理,2012,07:87-92+106.
[12]翟雪.直纹曲面与球面曲线[D].东北大学,基础数学,2010,硕士.
[13]张世厚.太钢热连轧卷取张力控制的改进[J].冶金自动化,1998,02:49-50.
[14]檀柳纯,刘思含,肖雅.产业转移视角下的金融支持——基于皖江示范区的实证分析[J].安徽理工大学学报(社会科学版),2014,04:28-35.
[15]张宇.电感耦合等离子发射光谱法测定水中的铜铅锌镉镍的运用[D].长安大学,环境工程（专业学位）,2014,硕士.
[16]沙莎.2007～2011年某疾病预防控制中心食品及公共场所从业人员体检资料分析[D].吉林大学,公共卫生,2012,硕士.
[17]冯文然.反应等离子喷涂纳米TiN涂层的研究[D].河北工业大学,材料学,2004,硕士.
[18]王一帆.我国地方人大预算监督研究[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[19]王丽.高中教师课程改革认同感研究[D].西南大学,课程与教学论,2013,硕士.
[20]陈俊.金银花提取物的物质基础和制备工艺研究[D].浙江大学,2010.
[21]李成.基于数据包络分析法的乡镇卫生院效率研究[D].山东大学,社会医学与卫生事业管理,2013,硕士.
[22]隋连香.脑瘫青少年跨越障碍物的运动生物力学分析[D].鲁东大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[23]MetaweeVijintanawan（刘美婷）.泰国员工工作压力对角色内绩效的影响[D].哈尔滨工业大学,企业管理,2014,硕士.
[24]张剑萍.当代大众文化的美学阐释[D].江西师范大学,文艺学,2004,硕士.
[25]毕南妮.送风口高度及送风参数对碰撞射流供暖效果的影响[D].东华大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[26]郭文满.石墨烯导热纳米复合材料的研究[D].华侨大学,材料加工工程,2013,硕士.
[27]罗永宏.西维因及其主要降解产物1-萘酚对普通小球藻生长效应影响的研究[D].南京农业大学,水生生物学,2011,硕士.
[28]姜在兴.面向中医临床处方分析的主题模型研究[D].北京交通大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[29]王亚南.中国刑法强奸罪问题完善研究[D].安徽大学,刑法学,2013,硕士.
[30]周庆玲.移动用户上网行为分析系统关键技术研究[D].北京交通大学,2014.
[31]白媛媛.大学生感恩、负性生活事件与幸福感的关系研究[D].南京师范大学,发展与教育心理学,2012,硕士.
[32]郭晓雨.汉日翻译实践报告[D].浙江工商大学,翻译（专业学位）,2013,硕士.
[33]黄荣坚.数据挖掘在高职院校招生中的应用研究[D].中山大学,软件工程,2014,硕士.
[34]姚舟杰.金融危机冲击与中国对美出口贸易变化[D].浙江工商大学,金融学,2013,硕士.
[35]傅岚.在数据海洋中打捞信息数据挖掘[J].科技广场,2002,11:38-41.
[36]黄远浙.外资进入速度与外商直接投资溢出效应[D].宁波大学,国际贸易学,2013,硕士.
[37]李东苇.PVA纤维增强水泥基复合材料力学性能及板的爆炸动力响应分析[D].长安大学,结构工程,2013,硕士.
[38]向东.不同时效状态下Al-Mg-Si型材的准静态压缩性能研究[D].湖南大学,材料加工工程,2012,硕士.
[39]田希.高管团队特征影响营运资金管理绩效的实证研究[D].西南交通大学,会计学,2013,硕士.
[40]李鹏.采用层间隔震的车辆段上盖剪力墙结构的抗震性能研究[D].北京建筑大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[41]韩丽娜.枪管超声检测技术研究与系统设计[D].中北大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[42]王梅.大豆质核互作雄性不育系NJCMS1A与保持系NJCMS1B差异表达基因的研究[D].南京农业大学,遗传学,2012,硕士.
[43]刘晓静.向列相液晶的自旋波理论研究[D].河北师范大学,凝聚态物理,2004,硕士.
[44]本报记者张梦然.寓科研于娱乐的人[N].科技日报,2010-10-08002.
[45]李伟光.城市山地公园景观规划设计研究[D].山东建筑大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[46]赵江,徐世录.反巡航导弹的现状与发展趋势[J].飞航导弹.2005(05)
[47]王景玉.大叶藻抑制松材线虫及其携带细菌活性成分的分离与鉴定[D].青岛大学,微生物学,2013,硕士.
[48]肖珂.网络体育新闻中的女性形象呈现[D].华中师范大学,新闻与传播,2014,硕士.
[49]黄彬.面向大批量定制的客户关系管理系统研究[J].福州大学学报(自然科学版),2005,05:614-618.
[50]叶新豪.公司实际控制人制度的形成与发展[D].复旦大学,民商法学,2012,硕士.