北极褐藻酸裂解酶分泌菌株的多样性分析和褐藻酸裂解酶的成熟与催化机制研究

北极褐藻酸裂解酶分泌菌株的多样性分析和褐藻酸裂解酶的成熟与催化机制研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-19 分类:期刊论文 喜欢:2589
师大云端图书馆

【摘要】褐藻酸主要是由褐藻或者特定种属的细菌产生的一类多糖。它们都是由p-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronate,M)与其差向异构体α-L-古罗糖醛酸(a-L-guluronate,G)两种残基通过1,4糖苷键相连而成的非支链共聚物,两种残基可以均聚,形成.M片段(polyM)或者G片段(polyG),或者交替排列形成MG片段(polyMG)。褐藻酸的降解都是依靠裂解酶类通过β-消除反应进行,而没有水解酶类参与。褐藻酸裂解酶能够降解某些致肺纤维囊肿疾病(cysticfibrosis,CF)细菌形成的褐藻酸多糖膜,因此可作为辅助治疗该类疾病的有效措施。最近,褐藻酸裂解酶也被用于从海藻制备生物乙醇的研究过程中。因此,褐藻酸裂解酶有重要的应用价值。在CAZY数据库(Carbohydrate-ActiveenZYmesDatabase)中,褐藻酸裂解酶分布于裂解酶(PolysaccharideLyase,PL)5\6、7、14、15、17、18家族中。褐藻酸裂解酶通过p-消除反应打开糖苷键,在C4和C5之间形成不饱和的双键。褐藻酸裂解酶已经从多种类型的物种中分离到,例如海藻、海洋软体动物、细菌、真菌甚至病毒等。北极地区是地球上的极端环境之一,生活在北极的生物形成了适应极端环境的独特机制,因此北极地区是开发利用新型生物资源的宝库。虽然目前已经有很多从附着在海带上的微生物中分离筛选褐藻酸裂解酶的研究报道,但是还没有对北极褐藻酸裂解酶产生菌株的研究。本论文以北极海带样品为研究材料,进行了产生褐藻酸裂解酶菌株的筛选和多样性分析,为进一步筛选新型适冷褐藻酸裂解酶奠定了基础。随着研究的深入,越来越多的褐藻酸裂解酶被解析了蛋白质结构,它们的结构与功能的关系也不断被阐明。PL18家族是裂解酶家族中比较新的一个家族,对该家族的研究还较少,还基本没有关于该家族褐藻酸裂解酶的底物识别机制、催化机制以及成熟机制的报道。Pseudoalteromonassp.SM0524是我们从烟台近海分离到的一株高产褐藻酸裂解酶的菌株,该菌所产的PL18家族褐藻酸裂解酶alySJ02是一种高效的双功能酶。该菌还分泌另一种PL7家族褐藻酸裂解酶alySJO1。本论文对PL7家族酶alySJO1的酶学性质和底物降解特异性机制、PL18家族酶alySJ02的成熟机制、底物识别和催化机制进行了研究。(1)北极海带样品产褐藻酸裂解酶菌株的筛选和多样性分析从取自北极地区的6个海带样品上,通过富集培养和涂布筛选平板,共挑取了74株菌进行划线纯培养,然后在16SrRNA基因序列分析基础上进行分子系统发育分析。结果表明它们是65株不同的菌,Psychrobacter、Psychromonas和Polaribacter是其中的优势属,占筛选到可培养菌株的75%以上。进一步从中筛选到了21株可以分泌褐藻酸裂解酶的菌株。系统发育分析表明这21株产酶菌株分布在5个属中,分别为Psychrobacter、Winogradskyella、Psedoalteromonas、Psychromonas和Polaribacter。我们首次发现来源于Psychrobacter、Winogradskyella、Psychromonas和Polaribacter属的细菌能分泌褐藻酸裂解酶。这些菌最适生长以及分泌褐藻酸裂解酶的温度大部分低于25℃,在低温环境下可以生长良好,表现出了明显的适冷特性。其中某些菌株的最大产酶能力超过了200U/mL。因此,北极的海带样品是筛选产适冷的褐藻酸裂解酶菌株的良好原材料。这些研究结果为进一步筛选新型适冷褐藻酸裂解酶奠定了基础。(2)PL7家族褐藻酸裂解酶alySJO1的酶学性质和底物特异性机制研究alySJO1是Psedoalteromonassp.SM0524编码的一个褐藻酸裂解酶基因。序列分析表明,该酶属于PL7家族,与已经研究过的来自Vibriosp.QY101的AlyVGI相似性最高,仅有41%的序列相似性,表明该酶的氨基酸序列具有新颖性。利用Escherichiacoli异源表达系统,克隆表达了alySJO1。对alySJO1的性质分析表明,alySJO1的最适酶活温度为30℃;并且该酶对热敏感,超过30℃的温度条件活性丧失很快,45℃条件下15min基本完全失活;该酶的Tm(Meltingtemperature)值仅为37℃,对SDS等变性剂的耐受能力很差,这表明alySJ01的结构柔性较强,稳定性较差。因此,以上结果表明alySJO1是一种适冷酶。alySJO1的最适pH为8.5;可以被NaCl激活,在0.6M(3.5%)的NaCl条件下酶活可以提高6倍,并具有很好的耐盐能力。这些性质表明,作为一个海洋来源的酶,alySJO1已经很好地适应了海水碱性、高盐、低温的环境。对酶解产物的分析表明,alySJO1酶解产物主要为二聚体和三聚体,也有少量的四聚体以及更高聚合度的产物。另外酶解产物中也有少量的单体存在,alySJO1是否具有外切酶活性尚需进一步验证。对alySJO1的底物特异性分析结果表明,该酶对PM片段的酶活非常高,但是对PG片段基本没有降解活性,表现出了非常好的PM降解特异性。在已经研究报道的褐藻酸裂解酶中,AlyVGI与alySJO1的序列相似性最高,但是底物特异性却不同。我们对这两者进行序列比对,发现这两个酶都有PL7家族典型的保守区,但是覆盖在催化腔的lid-loop上的差异非常大。另外,在催化腔附近也有一些氨基酸序列的差异,我们据此设计了突变。分别测定了alySJO1突变体对PM和PG片段降解活性的改变。结果表明,PL7家族褐藻酸裂解酶alySJO1底物降解特异性与催化腔中的保守的关键氨基酸关系不大,与降解偏好性有关的氨基酸多分布在催化腔周围以及lid-loop上,而这些氨基酸在该家族序列上不是很保守。因此,催化腔周围以及lid-loop上这些不保守氨基酸赋予了该家族酶多样的底物偏好性。(3)alySJ02的成熟机制及其N端结构域功能的研究序列分析表明,alySJ02的全基因包含四个部分:信号肽(Met1-Ala31)、N端结构域(ND)(Ala32-Gly155)、linker(Ser156-Ser173)和催化结构域(CD)(Thr174-Asn400)。PL18家族的ND在酶的成熟过程中被切除,成熟酶仅含有CD。我们在Escherichiacoli中单独表达alySJ02的ND和linker共含有142个氨基酸的蛋白,通过实验验证了该结构域蛋白具有多糖吸附功能。但是在酶原中,该结构域的存在并没有增加酶对底物的亲和力,不能发挥底物吸附功能。另外,在Escherichiacoli中单独表达的催化结构域虽然也有催化活力,但是与成熟酶相比,其催化活性要低20%左右。利用两个载体在Escherichiacoli中共表达ND和CD,结果表明这两个结构域蛋白能够通过相互作用结合到一起,形成一个复合物。但是,如果在不同的Escherichiacoli细胞中分别表达ND和CD,将折叠好的两者蛋白混合,他们不再有相互作用,不能形成一个复合物。这在天然条件是非常重要的,可以保证成熟过程中酶的linker位置被切断以后两者能顺利分离,使alySJ02的CD能形成成熟酶的形式。因此,生化证据证明了ND可以促进CD的折叠成熟。为了进一步分析ND促进CD折叠成熟的分子机制,我们对异源表达的CD蛋白和带有ND的前体进行了结晶。PDB数据库中来于Psedoalteromonassp.272的褐藻酸裂解酶(PDB.1J1T)与alySJ02成熟酶序列只有一个氨基酸残基差异,我们以其为模型,分别同源模建了alySJ02成熟酶的结构、解析了单独表达的CD和带有ND的前体中的CD的结构。通过结构比较分析,我们发现带有ND的前体中的CD的结构中关键氨基酸的构象与成熟酶是完全一样的,而在没有ND条件下,CD的折叠是不规范的。不对称单位的两个分子中,一个分子的构象与成熟酶基本一致,而另一个分子的很多保守氨基酸的空间构象与成熟酶差别非常大。因此,生化证据和结构分析都表明,在alySJ02的成熟过程中,ND可以促进催化结构域的正确折叠,特别是保证催化活性中心关键氨基酸的正确构象。这些实验结果表明,N端结构域在PL18家族褐藻酸裂解酶的成熟过程中可能起着分子内伴侣的功能。(4)PL18家族褐藻酸裂解酶alySJ02的底物识别和催化机制研究alySJ02蛋白的基本结构是由两层反向平行的p折叠片层卷曲围绕而成,与已经提交PDB数据库的PL7和PL18家族的褐藻酸裂解酶的结构非常类似。结构和原子吸收光谱分析表明,alySJ02蛋白中含有一个钙离子,钙离子虽然远离催化活性中心,但用EDTA螯合出酶中的钙离子会导致alySJ02的催化活性降低50%左右,因此钙离子虽然不参与到催化反应过程中,但是可以稳定酶结构,保持酶的高催化活性。在褐藻酸裂解酶催化腔上方普遍存在一种由2个loop组成的类似盖子的结构,这些loop称为lid-loop。我们对alySJ02的lid-loop进行分子动力学模拟,结果表明,alySJ02的2个lid-loop之间的距离可以从大约3A增大到11A左右,表现出了明显的开与合两种状态。通过双突变N216C/T263C在2个lid-loop间形成二硫键,会导致其柔性丧失,结果也使酶的活性完全丧失;加入还原剂DTT破坏二硫键使lid-loop的柔性逐步恢复,酶的催化活性也会逐步部分恢复。因此,lid-loop对alySJ02识别结合底物非常重要。为了分析alySJ02对底物的识别和催化机制,我们建立了alySJ02与一个4聚甘露糖醛酸寡糖的复合物的Docking模型。通过对alySJ02与底物的Docking模型的分析,确定了酶与底物的结合位点,其中,糖醛酸残基A-1被氨基酸残基Gln355和Lys364识别。在位点S+1,Gln257和His259识别结合糖残基A+1的羧基,Thr263识别结合02,Asn216识别结合03,Thr353识别结合04。糖残基A+2的羧基被Arg219和Lys349识别结合,03和04被His259识别结合。在位点S+3,羧基被Lys223和Thr347识别。对这些位点进行了突变验证,S+1和S+2位负责识别羧基的氨基酸非常保守,突变会导致酶完全失活,与糖残基的羟基作用的氨基酸突变后,会保留部分催化活性;S-1和S+3位参与了底物的识别结合过程的氨基酸用Ala置换突变后,酶的活性丧失,但是置换为性质接近的氨基酸时,可以保留酶的部分催化活力。有活性突变体的Km值增大,表明突变使酶与底物的亲和力降低。因此,alySJ02的底物识别结合位点主要是在S+1和S+2,这些位点的氨基酸主要是识别结合多糖的羧基,而与糖环上的羟基氧原子作用的氨基酸的保守性较差。S-1和S+3位点的氨基酸对底物识别也非常重要,但是比S+1和S+2位点的重要性稍弱。alySJ02对底物的识别机制决定了对底物进行充分酶解后的产物应该是以二聚体和三聚体为主,与之前的报道的实验结果一致。根据结构和突变分析结果,我们分析了alySJ02催化褐藻酸裂解的反应机制。保守氨基酸Arg219,Lys223,Gln257,His259和Lys349可以识别结合底物,特别是结合稳定底物的羧基基团:在反应过程中,这些氨基酸形成的正电势的催化中心对碳负离子的稳定也非常有利。氨基酸Tyr353与A+1的C5的距离为3.1A,与04的距离是3.3A,该氨基酸突变会导致酶完全失活,其他氨基酸离C5和04的距离都较远(>4A),因此推测Tyr353既可以作为催化碱又作为催化酸。因此,根据实验结果,我们提出了alySJ02的催化过程和机制:首先,在lid-loop开放状态下,酶与底物结合;Tyr353从A+1的C5位上获取质子,该位置形成碳负离子,保守氨基酸形成的正电势催化腔对其稳定十分有利;然后Tyr353又作为质子供体,将质子转移给04,导致糖苷键断裂,同时在C4与C5之间形成不饱和的双键。这是首次解析PL18家族褐藻酸裂解酶的成熟机制和底物识别与催化机制,研究结果为进一步研究该家族褐藻酸裂解酶的结构与功能及其应用开发奠定了基础。
【作者】东升;
【导师】张玉忠;陈秀兰;
【作者基本信息】山东大学,微生物学,2014,博士
【关键词】褐藻酸裂解酶;海洋细菌;底物特异性机制;催化机制;成熟机制;

【参考文献】
[1]杨琳琳.封闭室内自然对流数值研究[D].辽宁工程技术大学,供热、供燃气、通风及空调工程,2012,硕士.
[2]廖胜利,刘晓娟,刘本希,程春田,蔡华祥.省地县一体化电力调度管理系统分级用户权限方案[J].电力系统自动化,2013,18:88-92+135.
[3]刘万群,张晓勇,费新光.提高热叠轧薄板剪切精度的技术改造[J].河南冶金.2002(05)
[4]马志成.化学实验探究教学研究与实践[D].华中师范大学,2001.
[5]李静娴.权力的颠覆与抑制:对《狼厅》的新历史主义解读[D].湖北大学,英语语言文学,2011,硕士.
[6]崔丽.硅胶负载Keggin磷钨酸催化合成肉桂酸甲酯[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[7]胡钦乐.企业碳会计体系构建研究[D].山东财经大学,会计学,2012,硕士.
[8]崔洋洋.基于三蝶烯新型功能分子的设计与合成研究[D].华侨大学,有机化学,2013,硕士.
[9]周利建.巨尾桉反义4CL1基因的遗传转化及其Cu/ZnSOD酶基因的克隆[D].华侨大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[10]洪磊.无线中继网络中分布式差分空时码的设计[D].杭州电子科技大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[11]王涛.基于DEA的内蒙古自治区城乡最低生活保障资金效率研究[D].内蒙古大学,公共管理,2014,硕士.
[12]秦怡.国内服务贸易结构分析与提升[J].生产力研究,2014,08:156-157+160.
[13]陈博,俞立,张文安.具有测量数据丢失的离散不确定时滞系统鲁棒Kalman滤波[J].自动化学报,2011,01:123-128.
[14]李卓.中小企业服务供给的主体选择及其实现机制[D].清华大学,管理科学与工程,2003,硕士.
[15]张鹏程.浅谈塑料啤酒瓶新技术[J].包装世界.1999(06)
[16]梁路璐.“亲”“疏”之间看译者“隐”“显”[D].北京外国语大学,翻译,2014,硕士.
[17]朱夏.铋系钙钛矿结构薄膜材料的制备及性能研究[D].华东师范大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[18]韩豫,陈学东,刘全坤,张起侨,陈从升.奥氏体不锈钢应变强化工艺及性能研究[J].机械工程学报,2012,02:87-92.
[19]刘慈影.校本研修对中学英语教师专业发展提高的个案研究[D].湖南师范大学,英语课程与教学论,2013,硕士.
[20]马光志,陈凤华.基于关联规则的ABN分类器构造[J].计算机工程与科学,2005,05:84-87.
[21]蔡雨廷.甘肃省城乡高中生媒介素养现状对比研究[D].兰州大学,新闻学,2013,硕士.
[22]张学昌.中国赴美采购团甘当中美贸易逆差的“替罪羊”——论影响美国贸易政策的政治因素[D].对外经济贸易大学,国际贸易学,2004,硕士.
[23]刘波.无负压加压泵站在跨海输水管线中的水锤防护性能研究[D].浙江大学,水工结构,2013,硕士.
[24]李劲,华德铭.乌鲁木齐VLBI站前端系统[J].宇航计测技术.1997(01)
[25]宓思.商事仲裁调解中的新问题及其对策分析[D].深圳大学,国际法学,2013,硕士.
[26]李立煌.具有无线数据传输功能的瞬态温度测试系统[D].中北大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[27]王志军.自然口语中的话语标记“对不对”“对”研究[D].华中师范大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[28]陈峰.氢气饱和生理盐水抑制大鼠腹主动脉瘤形成的实验研究[D].中国人民解放军医学院,外科学,2013,硕士.
[29]何川.前交叉韧带虚拟重建系统的应用及术后膝关节内结构的三维有限元研究[D].昆明医科大学,外科学,2014,博士.
[30]陈蜜.基于戏剧符号学的戏剧翻译研究[D].湖南科技大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[31]朱婷姝.中美中学历史教材中“地理大发现”之比较[D].东北师范大学,学科教学(专业学位),2012,硕士.
[32]张勇丽.20世纪二三十年代写作教学思想及对当前写作教学的启示[D].河北师范大学,学科教学,2014,硕士.
[33]李佳静.中原油田言语社区语言变异研究[D].浙江财经学院,汉语言文字学,2013,硕士.
[34]付央.陆地棉背景下海岛棉第16染色体片段置换系的构建及相关农艺性状QTL定位[D].南京农业大学,遗传学,2013,硕士.
[35]严江琴.静态时序分析在百万门级设计中的应用[J].中国集成电路.2002(10)
[36]岳吉祥.深水半潜式钻井平台钻机系统选型与布局优化研究[D].中国石油大学,2009.
[37]苗冠一.腰腹部肌肉力量练习对不同锻炼行为阶段高中生体力活动水平的影响[D].河北师范大学,体育教学,2014,硕士.
[38]徐积明.政府知识管理初探[D].苏州大学,2004.
[39]陈勇斌.英语商务函电语篇实时构建研究[D].宁波大学,英语语言文学,2014,硕士.
[40]蒋莉莎.血清高迁移率族蛋白B1在急性胆管炎发生中的临床意义[D].苏州大学,消化内科,2013,硕士.
[41]孙田.地下水诱导结晶法除氟研究[D].西安建筑科技大学,市政工程,2013,硕士.
[42]贾梓纯.我国上市中小银行效率研究[D].首都经济贸易大学,金融学,2014,硕士.
[43]朱恒民,姬小利,王宁生.支持数据挖掘的知识库系统[J].西南交通大学学报,2005,03:406-411+416.
[44]熊科伟.我国人力资源会计的困境及出路探析[D].江西财经大学,会计学,2013,硕士.
[45]濮军.超级电容器电极材料的化学合成及其性能研究[D].安徽师范大学,2014.
[46]王睿.特殊形态结构导电高分子材料温阻效应研究[D].河南科技大学,化学工程(专业学位),2014,硕士.
[47]张健.基于张量子空间的图像特征提取方法研究[D].西安电子科技大学,信号与信息处理,2012,硕士.
[48]徐维祥,舒季君,陈国亮,唐根年.中国“四化”同步发展地区差异及同步合作区架构研究[J].浙江工业大学学报(社会科学版),2014,04:361-367.
[49]黄恩瑞.面对中国市场的韩国医疗观光产业分析[D].山东大学,旅游管理,2012,硕士.
[50]伍昌林.新型表面化学SPR蛋白芯片的构建及其在CITP免疫紊乱诊断中的应用[D].南方医科大学,临床检验诊断学(专业学位),2014,博士.

相关推荐
更多