小鼠DsbA-L基因的转录调控机制研究

【摘要】目的：二硫键氧化还原酶类似蛋白（DsbA-L）是近年发现的一种与脂联素多聚体形成有关的重要调节蛋白，它具有显著上调高分子量脂联素水平及增强胰岛素敏感性的作用，并且能缓解由内质网应激诱导的脂联素水平下降。DsbA-L转基因小鼠可抵抗高脂饮食诱导的肥胖、胰岛素抵抗和脂肪肝。DsbA-L在脂肪组织高度表达，表达量随脂肪细胞的分化显著增加。DsbA-L水平与肥胖呈负相关。目前对DsbA-L基因的转录调控鲜有研究。本研究拟对小鼠DsbA-L基因启动子活性进行分析，探讨DsbA-L基因启动子区及其相关转录因子对DsbAL表达的作用和可能机制。方法：1.构建DsbA-L基因全长启动子及5′或3′端系列缺失的荧光素酶报告基因表达质粒，分别转染HEK293和3T3-L1细胞，通过双荧光素酶活性检测系统检测报告基因活性，明确调控DsbA-L表达的重要启动子区域。结合生物信息学分析对DsbA-L基因转录调控起关键作用的潜在顺式作用元件。2.针对潜在的顺式作用元件，构建DsbA-L基因突变体荧光素酶报告基因表达质粒，双荧光素酶活性检测系统分析该作用元件对启动子活性的影响。3.电泳迁移率变动分析法（EMSA）以及染色体免疫共沉淀（ChIP）实验确认顺式作用元件与相应转录因子的特异结合。4.通过RNA干扰和过表达Sp1分析其对DsbA-L基因启动子活性的影响。5.采用实时荧光定量PCR及EMSA实验分析脂肪细胞分化以及高脂饮食干预对DsbA-L基因转录影响的可能机制。结果：1.DsbA-L基因最小启动子位于转录起始位点上游-186~-34。2.内含子1的+391~+432区域存在一个潜在的转录因子Sp1结合位点。EMSA和ChIP实验证实Sp1与该区域DNA之间存在特异性结合。过表达和RNA干扰实验分析显示，Sp1具有转录抑制作用。3.3T3-L1脂肪细胞分化过程中，DsbA-L转录水平显著升高；Sp1的表达水平降低，Sp1与其位于DsbA-L基因内含子1区域的DNA结合能力降低。4.与对照组相比，高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织DsbA-L基因转录水平显著降低，Sp1与其位于DsbA-L基因内含子1区域的DNA结合能力亦显著降低。结论：转录因子Sp1通过与DsbA-L基因内含子区域的作用元件相互作用负调DsbA-L基因的转录。第二部分白藜芦醇对DsbA-L基因的调控作用及其机制目的：探讨白藜芦醇上调DsbA-L基因表达的作用机制。方法：1.采用实时荧光定量PCR和Westernblot的方法检测白藜芦醇对HepG2细胞和3T3-L1细胞中DsbA-LmRNA和蛋白水平的影响。2.以荧光素酶报告基因实验分析白藜芦醇对DsbA-L基因启动子活性的影响。3.用电泳迁移率变动分析法（EMSA）检测白藜芦醇对转录因子Sp1与DsbA-L基因内含子区DNA结合的影响。4.用Westernblot方法检测白藜芦醇对Sp1蛋白表达的影响。结果：1.在HepG2细胞和3T3-L1细胞中，白藜芦醇能够上调DsbA-LmRNA和蛋白的表达水平。2.白藜芦醇可以显著增加DsbA-L基因启动子报告基因质粒p(-186to+432)Luc的荧光素酶活性，而对缺失Sp1结合位点的报告基因质粒p(-186to+432)Lucmut和p(-186to+391)Luc荧光素酶活性无显著影响。3.白藜芦醇显著下调转录因子Sp1的表达，并使Sp1与DsbA-L基因内含子区DNA的特异结合降低。结论：白藜芦醇通过抑制Sp1的表达上调DsbA-L基因的转录。
【作者】杨文静；
【导师】方启晨；
【作者基本信息】苏州大学，内科学，2014，硕士
【关键词】DsbA-L；启动子；Sp1；白藜芦醇；

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