鲜乳细菌总数荧光定量PCR检测方法的建立

【摘要】牛奶富含多种营养物质，是营养丰富的养生佳品，近年来我国消费规模逐渐上升。同时，鲜乳也是微生物生长繁殖的良好培养基，一旦与外界接触，就会受到来自各种途径的微生物污染威胁，被微生物污染的鲜奶品质会下降，一旦微生物数量超标，就不可再作为原料乳进行后续的乳制品的生产加工。因此，建立鲜乳中细菌总数快速检测方法对鲜乳的质量安全等级进行确定是十分必要的，是乳品企业和消费者的共同需求。本实验利用荧光定量PCR技术，定量鲜乳样品中细菌的16SrDNA，建立判断鲜乳中细菌是否超标、能否作为原料乳进行后续加工的快速检测方法。首先对广泽乳业牧场及收购的约500份鲜乳样品进行污染细菌的分离，利用生化实验及16SrDNA序列测序法对细菌种类进行鉴定，分析广泽乳业牧场及收购的鲜乳常见的污染细菌种类，建立污染细菌谱。结果显示，常见的污染鲜乳的细菌有：格式乳球菌、血链球菌、中间葡萄球菌、克氏库克菌、溶血性葡萄球菌、阴沟肠杆菌、雷根斯堡约克氏菌、蜂房哈夫尼亚菌、大肠埃希菌、阪崎肠杆菌，绿浅气球菌、粘质沙雷菌、产酸克雷伯菌。以此污染细菌谱为分析对象，设计一对16SrDNA通用引物，PCR扩增片段长度为293bp，用作荧光定量PCR定量的模板。通过对纯细菌悬液和人工加标污染牛奶样品中的细菌16SrDNA进行定量，建立细菌浓度lgCFU和CT值的标准曲线。参照国标GB19301-2010，当鲜乳中的细菌总数达到2×106CFU/g（mL）时，鲜乳的质量安全就会受到威胁，超过这个限值的鲜奶不允许用作原料乳，对细菌浓度在2×106CFU/mL时的纯细菌悬液和人工加标污染牛奶的CT值进行分析，得到了鲜乳细菌数量超标的参考CT值范围。结果显示：细菌浓度为2×106CFU/mL的纯细菌悬液的CT值范围为27.03~30.17，相同细菌浓度的人工加标污染牛奶样品的CT值范围为29.81~31.49。对100份实际鲜乳样品同时运用国标法和荧光定量PCR法检测，验证荧光定量PCR方法的准确性。结果显示，人工加标污染牛奶样品所得的CT值范围（29.81~31.49）可作为实际鲜乳样品细菌是否超标的参考范围。该方法的准确率在90%以上，检测时间在4h左右，是一种快速检测鲜乳细菌总数的新方法，能够为鲜乳样品的质量等级进行快速的确定。
【作者】刘艳艳；
【导师】柳增善；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】鲜乳；细菌总数；荧光定量PCR；检测；

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