三氧化二砷诱导血小板凋亡及其相关机制探讨

【摘要】目的：探讨临床使用浓度的三氧化二砷（Arsenictrioxide,ATO）是否会诱导血小板凋亡，并研究ATO诱导血小板凋亡的信号传导机制。方法：收集健康志愿者新鲜静脉全血，分离得到洗涤血小板及富含血小板血浆（Plateletrichplasma,PRP）。洗涤血小板（3×108/ml）与不同浓度ATO或者阴性对照二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide,DMSO）于37℃孵育5小时，使用流式细胞仪检测血小板线粒体跨膜电位（Mitochondrialinnertransmembranepotential,ΔΨm）变化、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）外翻、血小板活化指标P-选择素（P-Selectin）及血小板激活复合物（Pateletactivatedcomplex-1,PAC-1）的结合率。使用Westernblot检测ATO与正常人洗涤血小板孵育后血小板促凋亡蛋白Bax，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表达和caspase-3的活化情况。为了探明c-Jun氨基末端激酶（c-junNH2-terminalkinase，JNK）蛋白家族在ATO诱导的血小板凋亡过程中的作用，我们使用JNK蛋白特异性抑制剂双香豆素抑制JNK蛋白活性，之后使用流式检测ATO诱导的血小板ΔΨm的变化。同时我们研究了ATO对不同致聚剂诱导血小板聚集功能的影响，探讨ATO对血小板功能有无损伤，将PRP与ATO（2μM）或者阴性对照（DMSO）于37℃孵育1小时,洗涤血小板与ATO（16μM）或阴性对照（DMSO）于37℃孵育2小时后，PRP中加入胶原（Collagen,5μg/mL）或者二磷酸腺苷（Adenosinediphosphate,ADP,10μmol/L），洗涤血小板中加入凝血酶（Thrombin,0.5U/mL），1000rpm剪切力的情况下，使用血小板聚集仪检测血小板聚集程度。ATO治疗相关血小板减少已经在临床中被大量报道，为了探明ATO是否会引起循环血小板计数减少，我们通过连续注射临床使用浓度的ATO至实验小鼠体内，之后使用SysmexKX-21N血细胞计数仪测定小鼠血小板计数，研究ATO对C57小鼠外周血血小板数量有无影响。结果：1.ATO诱导血小板凋亡体外研究结果显示，与正常阴性对照相比，ATO剂量依赖性诱导血小板ΔΨm去极化以及PS外翻，Westernblot检测ATO与正常人洗涤血小板孵育后，血小板抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL下调，促凋亡蛋白Bax增强表达，ATO剂量依赖性诱导血小板caspase-3活化裂解，且ATO剂量依赖性引起JNK活化，使用JNK特异性抑制剂双香豆素可以抑制ATO诱导的血小板ΔΨm去极化，然而双香豆素并不能完全抑制这一过程，提示可能有其它信号途径参与这一过程。以上实验结果表明，ATO通过caspase依赖的线粒体途径诱导血小板凋亡。2.ATO损伤血小板聚集功能既往研究表明，ATO抑制花生四烯酸、肾上腺素、凝血酶以及U46619诱导的血小板聚集，然而对于胶原诱导的血小板聚集存在不同的观点。我们通过研究表明，ATO抑制胶原、ADP以及凝血酶诱导的血小板聚集，提示ATO损伤血小板的聚集功能。3.小鼠体内实验大量研究表明，ATO治疗急性早幼粒细胞白血病（Acutepromyelocyticleukemia，APL）或者其他恶性肿瘤过程中常伴随血小板减少。然而，相关机制仍不清楚。我们上述研究已经表明，ATO在体外能够诱导血小板凋亡，为了进一步探明ATO是否对循环血小板计数产生影响，临床治疗相关剂量的ATO或0.9%生理盐水（Normalsaline,NS）对照通过腹腔注射C57小鼠，连续5天，之后使用血细胞计数仪测定外周血血小板计数变化。实验表明，通过连续腹腔注射临床使用浓度的ATO使小鼠外周血血小板计数发生减少。结论：综上所述，ATO通过caspase依赖的线粒体途径诱导血小板凋亡，JNK蛋白家族在其中发挥重要作用，ATO不仅抑制血小板功能，而且引起体内循环血小板数量减少。提示肿瘤病人使用ATO治疗伴随血小板减少的可能机制。
【作者】吴义存；
【导师】戴克胜；
【作者基本信息】苏州大学，血液病学，2014，硕士
【关键词】三氧化二砷；血小板；凋亡；JNK活化；

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