玉米抗氧化肽的制备、分离纯化及结构鉴定

【摘要】本研究由国家科技支撑计划课题-食源性功能肽生物制备技术研究（2012BAD33B03）资助。本研究首先利用碱性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分别对玉米蛋白粉进行酶解，发现碱性蛋白酶酶解物具有较好的抗氧化活性和水解度。将筛选出的碱性蛋白酶与风味酶结合分步水解玉米蛋白粉制备玉米抗氧化肽，并通过多元线性回归设计和响应面设计建立酶解模型，所得模型的拟合度良好，具有工程化指导意义。通过对模型的分析得到了最优工艺参数，碱性蛋白酶：pH为9.5、加酶量为8%、料液比为1:25、酶解时间为75min；碱性蛋白酶-风味酶：pH为7、加酶量为4.2%、酶解时间为66min。在此工艺参数下进行重复验，所得玉米蛋白粉酶解物的DPPH自由基清除活性为26.3%、Fe2+螯合活性为46.3%。然后利用超滤技术对玉米蛋白粉酶解物进行了初步分离得到了不同分子量分布的酶解物，并对其进行了抗氧化活性的测定。抗氧化活性则通过自由基清除活性、金属离子螯合活性和脂质过氧化抑制活性进行评价。结果表明分子量<10kDa的玉米蛋白粉酶解物在所有相关测定中都呈现出最好的抗氧化活性。然后利用凝胶色谱对其进行进一步分离，在所得到的分离组分中F3呈现出最好的抗氧化活性。利用LC-ESI-Q-TOF对F3中肽进行了结构鉴定：Leu-Pro-Phe(375.46Da)、Leu-Leu-Pro-Phe(488.64Da)和Phe-Leu-Pro-Phe(522.64Da)。采用FMOC固相合成的方法对所得到的肽进行合成，并进行了活性测定，结果表明这些肽具有很好的自由基清除活性和脂质过氧化抑制活性。从玉米蛋白粉中制备了玉米醇溶蛋白。然后用四种蛋白酶对所得到的玉米醇溶蛋白进行酶解，结果发现碱性蛋白酶酶解物具有很好的抗氧化活性。利用均匀设计实验对碱性蛋白酶酶解时的可控参数进行了优化。其最优工艺为：pH为8.5、加酶量为12%和酶解时间为90min。通过超滤实验发现，分子量<3kDa的玉米醇溶蛋白酶解物在自由基清除活性测定、金属离子螯合活性测定和脂质过氧化抑制活性测定中都呈现出最好的抗氧化活性。然后用凝胶色谱对分子量<3kDa的玉米醇溶蛋白酶解物进行了进一步分离纯化，在得到的6个组分中，F3呈现出最好的抗氧化活性。用LC-ESI-Q-TOF从组分F3中鉴定出了2条肽Pro-Phe(262.13Da)和Leu-Pro-Phe(375.46Da)。采用FMOC固相合成的方法对所得到的肽进行了合成，并对其活性进行了测定。在相关测定中，Pro-Phe呈现一定的抗氧化活性。以从玉米蛋白粉中分离纯化得到玉米抗氧化肽Leu-Pro-Phe为研究对象，探讨了温度、pH、食品配料、金属离子和胃肠道消化酶对Leu-Pro-Phe清除DPPH和ABTS自由基能力的影响。结果表明：玉米抗氧化肽Leu-Pro-Phe具有较好的热稳定性，在100℃下处理5h后仍能保持较好的自由基清除活性。Leu-Pro-Phe具有良好的耐酸耐碱性，酸性环境和碱性环境均未破坏其结构，其中碱性环境有助于其清除ABTS自由基。食品配料对Leu-Pro-Phe的抗氧化活性影响显著，其中蔗糖、NaCl和柠檬酸能极显著(p<0.01)的增加其DPPH自由基清除活性。常见的金属离子对Leu-Pro-Phe抗氧化活性的影响不一，K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+和Cu2+均能显著(p<0.05)影响Leu-Pro-Phe的DPPH自由基清除活性，而其ABTS自由基清除活性仅对Cu2+敏感，高浓度的Cu2+能显著(p<0.05)抑制其清除活性。经体外消化实验发现Leu-Pro-Phe具有一定的抗消化能力，经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后仍保持较好的自由基清除活性。
【作者】唐宁；
【导师】庄红；
【作者基本信息】吉林大学，食品科学，2014，硕士
【关键词】玉米蛋白粉；玉米醇溶蛋白；抗氧化；肽；稳定性；

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