MiR-200a对人胰腺癌干细胞上皮—间质转化（EMT）及体外生物学行为影响的实验研究

【摘要】目的研究miR-200a对从人胰腺癌细胞系PANC-1分选出的胰腺癌干细胞（Pancreaticcancerstemcells，PCSCs）EMT及体外生物学行为的影响。探索靶向调控胰腺癌干细胞中miR-200a的表达在预防及治疗胰腺癌方面的可行性。方法(1)细胞培养和流式细胞仪分选将人胰腺癌细胞系PANC-1细胞接种于由含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基、青霉素(10U/ml)和链霉素(100μg/ml)组成的培养基中，在5％CO2，饱和湿度，恒温37°C培养箱中培养。分散后的细胞进行计数，移至5ml的试管中，用PBS洗涤两次，以1×106/100μl重新悬浮于PBS中。分别加入抗人CD24-PE、抗人CD44-APC和抗人ESA-FITC抗体（稀释度均为1:40），避光冰上孵育20min。根据厂商说明书将各自同型对照抗体配成相同浓度使用。PBS洗涤2次，样本用500μlPBS重悬，进行流式细胞仪分选。细胞常规分选两次，并重新分析的纯度，保证分选后的细胞纯度>97％。数据用BDFACSDiva的软件进行分析。(2)转染miR-200模拟物将CD24+CD44+ESA+胰腺癌干细胞接种在6孔板中并孵育过夜。将含miR-200模拟物或者阴性对照序列的EntransterTM-R转染液（配制成终浓度25nM）转染细胞。转染6小时后更换培养液以避免细胞死亡。(3)实时定量RT-PCR根据说明书用Trizol法提取总RNA，使用PowerSYBR_greenPCRmastermix试剂盒进行实时定量RT-PCR分析E-cadherin、N-cadherin、vimentin、ZEB1、Oct4和Nanog的mRNA表达。以GAPDH为内参照。(4)microRNA表达分析使用miScriptReverseTranscriptionKit逆转录细胞总RNA。使用miScriptPCRKit进行RT-qPCR分析转染组与非转染组、阴性对照组胰腺癌干细胞miR-200a表达水平。以U6为内参照。(5)Westernblot检测用RIPA裂解缓冲液裂解细胞并测定蛋白质浓度。SDS-PAGE分离总蛋白并转移到聚偏氟乙烯膜。配制含5%脱脂奶粉、0.1%Tween20的TBST缓冲溶液封闭膜，加一抗（兔抗人Oct4,l:2000；兔抗人Nanog,1:2000；兔抗人N-cadherin,1:1000；鼠抗人Vimentin,1:500；兔抗人E-cadherin,1:1000；兔抗人ZEB1,1:1000）室温孵育2小时。再加入HRP-偶联的二抗（HRP-羊抗兔IgG抗体，1:5000；HRP-羊抗小鼠IgG抗体，1:5000）室温孵育1小时，增强化学发光检测系统检测结果。提取未转染和已转染miR-200a模拟物的细胞总蛋白进行Westernblot，检测E-cadherin、N-cadherin、ZEB1、vimentin、Oct4和Nanog蛋白表达水平。以β-actin为内参照。(6)Transwell小室迁移实验1×105PCSCs被平铺于非涂覆膜的上室，使其可以朝向下室中含血清的培养基迁移。孵育48小时后多聚甲醛固定细胞，以0.1％结晶紫（2mg/ml）染色。在光学显微镜下计数通过膜孔迁移的细胞数量。每孔观察3个随机视野。(7)Transwell小室侵袭实验1×105PCSCs置于Matrigel涂覆膜的上室，检测前每孔涂覆Matrigel60mg。细胞平铺在不含血清或生长因子的培养基中，而添加血清的培养基被用作化学诱导剂置于下室中。将细胞孵育48小时后，用棉签除去未通过膜孔侵入下室的细胞。收集膜下表面的细胞，用多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染色。在光学显微镜下计数侵入到膜下表面的细胞数量。每孔观察3个随机视野。(8)CCK法检测细胞增殖能力和对吉西他滨敏感性调整各组细胞密度，按照每孔1000-3000个细胞/100μl培养基接种于96孔板中，各孔在不同时间点（24h、48h、72h、96h）或者在加入不同浓度（50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、2000ng/ml）吉西他滨后72h加入10μlCCK-8，37°C、5%CO2孵育3h。用酶标检测仪（测定波450nm）测定各孔吸光密度值。结果(1)在PNC-1细胞中有（1.442±0.532）%细胞呈CD44+CD24+，而仅有（0.492±0.334）%细胞呈CD44+CD24+ESA+。Oct4和Nanog基因在CD44+CD24+ESA+细胞中表达显著上升。(2)定时RT-PCR显示miR-200a、E-cadherin在PCSCs中表达显著下调，而N-cadherin、vimentin和ZEB1表达则显著上调。(3)在PCSCs中过表达miR-200a导致在mRNA水平上上皮表型标志物E-cadherin表达上调，而间质表型标志物N-cadherin、Vimentin和ZEB1和胚胎干性基因Oct4和Nanog表达下调。Westernblot检测结果显示PCSCs过表达miR-200a后E-cadherin蛋白表达上调，ZEB1、N-cadherin、Oct4和Nanog蛋白表达下调，而Vimentin蛋白表达未见下调。(4)Transwell实验显示转染组相比非转染组或阴性对照组迁移和侵袭至膜下表面的细胞数目显著减少，分别下降了0.33倍和0.22倍。(5)CCK-8法检测结果显示转染组胰腺癌干细胞增殖能力下降，对吉西他滨的敏感性增强。结论在本研究中，我们发现miRNA在调控肿瘤干细胞EMT特征方面发挥了重要的作用，通过过表达miR-200a能够逆转胰腺癌干细胞的EMT表型和抑制胰腺癌干细胞的体外恶性生物学行为，为未来设计以miRNA为基础的胰腺癌靶向治疗方法提供了重要的理论和实验依据。
【作者】陆洋；
【导师】钱海鑫；
【作者基本信息】苏州大学，普通外科（专业学位），2014，博士
【关键词】肿瘤干细胞；上皮-间质转化；胰腺癌；miR-200a；

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