硝酸与亚硝酸对Shewanella oneidensis的生理影响机制

【摘要】硝酸与亚硝酸是环境中广泛存在的化学物质,对各种生物均有不同程度的影响。Shewanellaoneidensis是属于Y-变形菌纲的兼性厌氧菌,具有还原多种无机和有机化合物的能力而成为研究呼吸机制的模式菌株。在无氧条件下,硝酸和亚硝酸对S.oneidensis的生长有明显的抑制作用,同时该菌也可以利用硝酸和亚硝酸作为电子受体支持自身生长。根据理论推理,这种抑制和还原利用现象在有氧条件下依然有可能存在。因此,本研究对有氧条件下硝酸和亚硝酸对S.oneidensis的生理影响展开了系统研究,主要的研究结果归结于以下几个方面：1.有氧条件下,不同浓度硝酸对S.oneidensis生长的抑制机制不同。高浓度NaNO3(≥100mM)的抑制作用是由Na+胁迫造成；低浓度NaNO3(≤50mM)的抑制作用却因S.oneidensis将N03-还原成N02-,后者积累到一定浓度导致细胞的生长受到抑制。2.基于全局调控蛋白Crp缺失突变体Acrp对亚硝酸敏感的表型,利用转座子突变技术对Δcrp进行随机突变,发现受Crp正调控的bd-型细胞色素Cyd是S.oneidensis抵抗亚硝酸进行有氧生长的末端氧化酶,揭示亚硝酸对S.oneidensis生长抑制的靶点是cbb3-型细胞色素氧化酶(Cco)。在S.oneidensis中,亚硝酸对细胞的抑制可能由其胞内转化物NO引起。进一步研究表明有氧条件下S.oneidensis对NO有相对较强的抗性来自于亚硝酸还原酶NrfA的NO还原能力和bd-型细胞色素氧化酶对NO的较强抵抗能力。因此,细胞对NO和亚硝酸的应答机制存在一定差异,在氮氧化物胁迫下bd-型末端氧化酶负责细胞的有氧呼吸。3.有氧条件下,S.oneidensis对硝酸到铵的还原过程与无氧条件下典型的两步反应有所不同。有氧条件下,任何时候添加硝酸,S.oneidensis能够立即进行硝酸的还原,这种还原过程与消除多余的还原力无关。无氧条件下硝酸还原为亚硝酸后立即开始亚硝酸到铵的还原过程；然而在有氧条件下,亚硝酸还原并不在硝酸全部被还原后立即启动,而是经过一段时间,直到稳定期后期才开始进行。单独添加亚硝酸时,亚硝酸的还原也必须到稳定期后期才能发生,这主要归因于O2/H2O、NO3-/NO2-、NO2-/NH4+的标准还原电动势差异。4.Cyd缺失突变体Δcyd对亚硝酸非常敏感,在Δcyd中,利用一端含有启动子的Tn5转座子随机插入基因组,获得过量表达突变株。通过筛选亚硝酸的抗性恢复菌株,捕获了膜间细胞色素c蛋白ScyA。实验证明,在有氧条件下ScyA参与了有氧呼吸,可以从电子转运蛋白CymA和PetABC获得电子,传递给Coo。在亚硝酸存在条件下,在Δcyd中过量表达ScyA蛋白时,提高了Cco获得电子的机会,恢复了Δcyd的生长缺陷。
【作者】张海燕；
【导师】高海春；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】S.oneidensis；硝酸与亚硝酸；氧化还原；有氧呼吸途径；细胞色素蛋白；

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