Th17和Treg细胞对帕金森病模型小鼠的神经炎症和多巴胺能神经元损伤的作用及其机制研究

【摘要】目的辅助性T（helperT,Th）17细胞和调节性T（regulatoryT,Treg）细胞是上世纪末被证实的两种CD4+T细胞亚群。已有报道说明，Th17细胞具有很强的致炎症作用，在慢性炎症和自身免疫性疾病中发挥重要作用，而Treg细胞具有明显的免疫抑制作用，在免疫耐受和免疫稳态中起重要作用。近年来的研究表明，神经退行性疾病–帕金森病（Parkinson’sdisease,PD）的发病机制中也涉及了神经免疫的紊乱，主要表现为脑内小胶质细胞（固有免疫细胞）的过度激活导致了神经炎症，继而诱发和加重了PD的病理过程。然而，关于Th17和Treg这两种适应性免疫细胞在PD中的作用及其机制仍然知之甚少。为此，本研究探讨Th17和Treg细胞对PD的神经炎症和多巴胺能神经元丢失的作用，并且从胶质细胞激活介导和神经元直接接触分子这两个方面揭示Th17和Treg细胞的作用机制。研究可为临床上解释PD的发病机制和设计PD的防治措施提供新的实验依据。方法1.PD小鼠模型的制作：7-8周龄的C57BL/6小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP），20mg/kg/次，共注射4次，每次间隔2h，制备PD小鼠模型。未作任何处理的小鼠和腹腔注射等量生理盐水的小鼠作为对照。2.PD模型小鼠的评价：在MPTP末次注射后的第2天和第7天，用转棒、爬杆和旷场试验观察动物的运动和行为学变化；用免疫荧光组织化学染色法观察小鼠中脑黑质致密部（substantianigraparscompacta,SNpc）酪氨酸羟化酶（tyrosinehydroxylase,TH）的免疫反应阳性神经元的数量；用高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography,HPLC）检测纹状体内多巴胺（dopamine,DA）的含量。3.PD模型小鼠Th17和Treg细胞渗入脑实质的检测：在MPTP末次注射后的第2天和第7天，将FITC结合的白蛋白经心脏注入血液循环，观察小鼠SNpc中FITC结合的白蛋白的渗漏情况来判断血脑屏障的完整性。并且，应用免疫荧光双标染色法检测在SNpc中CD4与Th17细胞的核转录因子–维甲酸相关孤儿受体γt（retinoid-relatedorphannuclearreceptorγt,RORγt）共表达的细胞，及检测CD4与Treg细胞的核转录因子–叉头蛋白p3（forkheadboxp3,Foxp3）共表达的细胞。4.PD模型小鼠脑内Th17和Treg细胞功能失衡的检测：在MPTP末次注射后的第2天和第7天，应用实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测中脑黑质中，Th17细胞的特异性转录因子RORγt及致炎细胞因子–白介素（interleukin,IL）-17和IL-22的表达；并检测Treg细胞的特异性转录因子Foxp3及抗炎细胞因子–转化生长因子（transforminggrowthfactor,TGF）-β和IL-10的表达。应用免疫荧光双标技术观察IL-17和TGF-β在Th17（RORγt+）细胞、Treg（Foxp3+）细胞、神经元（NeuN+）、小胶质（CD11b+）细胞和星形胶质（GFAP+）细胞中的表达和定位情况。5.PD模型小鼠脑内存在胶质细胞介导的神经炎症的检测：在MPTP末次注射后的第2天和第7天，应用实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测中脑黑质中，炎性介质–肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）-α、IL-1β、干扰素（interferon,IFN）-γ和诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase,iNOS）的表达，以及神经营养因子–胶质细胞源性神经营养因子（glialcellderivedneurotrophicfactor,GDNF）和脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF）的表达。应用免疫荧光双标技术观察TNF-α和GDNF在小胶质（CD11b+）细胞和星形胶质（GFAP+）细胞中的表达和定位情况。6.PD细胞模型的制作和评价：取小鼠胚胎13天的中脑腹侧组织进行原代细胞培养，培养7天后加入MPP+（5μM）作用24h，然后用免疫荧光细胞化学法标记TH和NeuN阳性细胞，分别计算DA能和非DA能神经元的数目。7.检测Th17和Treg细胞对MPP+诱导的DA能神经元丢失和神经炎症的影响：首先取正常小鼠脾脏进行体外诱导分化Th17细胞和体外分选活化Treg细胞，然后将这些细胞加入到小鼠胚胎13天的中脑腹侧原代细胞培养物中，共培养1h后，加入MPP+作用24h。应用免疫荧光细胞化学法分别计算DA能和非DA能神经元的数目；实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测培养物中致炎细胞因子–TNF-α和IL-1β，以及神经营养因子–GDNF、BDNF和胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor,IGF）-1的mRNA和蛋白的表达。8.检测Th17细胞通过与DA能神经元直接接触的机制加重MPP+的神经毒性：我们设想Th17细胞通过膜分子–淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocytefunction-associatedantigen-1,LFA-1）与DA能神经元的膜分子–细胞间粘附分子-1（intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1）的相互作用加重MPP+的神经毒性。取小鼠脾脏经体外诱导分化获得Th17细胞；取小鼠胚胎13天的中脑腹侧组织进行原代细胞培养（用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长）获得神经元。首先，应用免疫荧光细胞化学法确定RORγt与LFA-1的共表达及TH与ICAM-1的共表达。其次，用中和性的抗LFA-1抗体处理Th17细胞，再将这种已抑制LFA-1活性的Th17细胞加入到神经元中；或者用中和性的抗ICAM-1抗体处理神经元，再将正常的Th17细胞加入到这种已抑制ICAM-1活性的神经元中，共培养1h，再加入MPP+作用8h（检测蛋白表达）或24h（检测神经元丢失），然后去除Th17细胞。用免疫荧光细胞化学法检测TH+NeuN+的DA能神经元和TH-NeuN+的非DA能神经元的数目；应用Westernblot法检测磷酸化c-jun氨基末端激酶（c-junN-terminalkinase,JNK）的水平及激活蛋白-1（activatorprotein-1,AP-1）、基质金属蛋白酶（Matrixmetallopeptidase,MMP）-9和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3的表达。最后，应用活细胞工作站观察标记LFA-1的Th17细胞与标记ICAM-1的神经元之间相互作用的动态图像。9.检测Treg细胞通过与DA能神经元直接接触的机制减轻MPP+的神经毒性：我们设想Treg细胞通过跨膜分子CD47与DA能神经元的跨膜分子信号调节蛋白α（signalregulatoryproteinα,SIRPA）的相互作用减轻MPP+的神经毒性。取小鼠脾脏经体外分选激活而获得Treg细胞；取小鼠胚胎13天的中脑腹侧组织进行原代细胞培养（用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长）获得神经元。首先，应用免疫荧光细胞化学法确定Foxp3与CD47的共表达及TH与SIRPA的共表达。进一步在活细胞工作站上观察标记CD47的Treg细胞与标记SIRPA的神经元之间相互作用的动态图像。其次，利用基因干扰技术沉默Treg细胞内的CD47，再将沉默了CD47基因的Treg细胞与神经元共培养1h；或利用基因干扰技术沉默神经元内的SIRPA，再将正常Treg细胞与沉默了SIRPA基因的神经元共培养1h，加入MPP+作用8h（检测蛋白表达）或24h（检测神经元丢失）。然后去除Treg细胞。应用免疫荧光细胞化学法检测DA能神经元和非DA能神经元的数目；用GSTpull-down技术检测Rac1的活化水平；用Westernblot法检测磷酸化Akt的水平及Bcl-xl和caspase-3的表达。最后，将Rac1抑制剂NSC23766预处理30min后的神经元与Treg细胞共培养，再用MPP+刺激8或24h，应用免疫荧光细胞化学法检测DA能神经元及非DA能神经元的数目；用Westernblot法检测磷酸化Akt的水平、Bcl-xl和caspase-3的表达。结果1.小鼠腹腔注射MPTP诱导了PD样的改变：小鼠在腹腔注射MPTP后的第2天和第7天，转棒测试中的掉落潜伏期明显短于未作处理的对照小鼠和腹腔注射生理盐水的对照小鼠，而爬杆试验中的完成时间明显延长，及旷场试验中的跨格数显著减少。同时，SNpc中TH免疫反应阳性神经元的数量明显减少，纹状体内DA的含量显著降低。这些变化在MPTP注射后第7天比第2天更明显。2.PD模型小鼠的SNpc中血脑屏障破坏及Th17和Treg细胞渗入脑实质：在PD模型小鼠的SNpc中，可见到FITC-白蛋白渗出到血管周围，这种现象在MPTP注射后第7天比第2天更显著。此外，PD模型小鼠SNpc中的CD4+和RORγt+的细胞增多，可见明显的CD4/RORγt和CD4/Foxp3双阳性的细胞。3.PD模型小鼠脑内Th17和Treg细胞的功能失衡：PD模型小鼠中脑黑质中，Th17细胞的特异性转录因子RORγt和致炎细胞因子IL-17及IL-22的mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组，而Treg细胞的抗炎细胞因子TGF-β和IL-10的mRNA和蛋白的表达则明显低于对照小鼠，但其特异性转录因子Foxp3的表达无显著变化。此外，在SNpc中，IL-17与RORγt和GFAP都具有共定位，且这些共定位的细胞在PD模型的SNpc中增加；但IL-17与CD11b和NeuN都没有明显的共定位。与此不同，TGF-β与SNpc中的4种细胞Treg细胞（Foxp3+）、神经元（NeuN+）、小胶质细胞（CD11b+）和星形胶质细胞（GFAP+）均有共定位，并且这些共定位的细胞在PD小鼠的SNpc中减少。4.PD模型小鼠脑内存在胶质细胞介导的神经炎症：在PD模型小鼠的中脑黑质中，炎症介质TNF-α、IL-1β、IFN-γ及iNOS的mRNA和蛋白的表达均显著上调，但神经营养因子GDNF和BDNF的基因和蛋白的表达明显下调。此外，TNF-α在小胶质细胞和星形胶质细胞中均有表达，但在PD模型小鼠的SNpc中表达增加；同样，GDNF在小胶质细胞和星形胶质细胞中也都有表达，但在PD模型小鼠的SNpc中表达减少。5.在PD细胞模型中，Th17细胞加重了MPP+诱导的DA能神经元丢失、炎性介质上调及神经营养因子下调，而Treg细胞减轻了MPP+的这些毒性作用：MPP+导致中脑腹侧原代细胞培养物中的TH+NeuN+DA能神经元的数目明显减少、致炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达明显增加、神经营养因子GDNF、BDNF和IGF-1的表达明显降低。Th17细胞预处理中脑腹侧原代细胞培养物后加重了上述所有MPP+诱导的变化；而Treg细胞预处理后明显减轻了MPP+单独或协同Th17细胞所产生的上述毒性作用。6.Th17细胞通过与DA能神经元直接接触的机制加重MPP+的神经毒性作用：①膜表面分子LFA-1与RORγt有共表达，但与TH无共表达；膜表面分子ICAM-1与TH和RORγt均有共表达。②用抗LFA-1抗体处理后的Th17细胞不能加重MPP+诱导的DA能神经元的丢失，也不能加重MPP+诱导的caspase-3表达上调。同样，Th17细胞加入到已用抗ICAM-1抗体预处理的神经元后，也不能加重MPP+诱导的上述所有变化。此外，抗LFA-1抗体处理还抑制了Th17细胞上调磷酸化JNK水平及AP-1和MMP-9表达的作用；Th17细胞亦不能上调已用抗ICAM-1抗体预处理的神经元中磷酸化JNK水平及AP-1和MMP-9表达。③活细胞工作站中观察到Th17细胞的膜分子LFA-1与神经元的膜分子ICAM-1具有相互作用的动态图像。7.Treg细胞通过与DA能神经元直接接触的机制减轻了MPP+的神经毒性作用：①跨膜分子CD47与Foxp3有共表达，也与TH有共表达；但跨膜分子SIRPA只与TH有共表达，而与Foxp3无共表达。②利用活细胞工作站可见Treg细胞的CD47与神经元的SIRPA具有直接接触的相互作用。③沉默了CD47基因后的Treg细胞不能减轻MPP+诱导的DA能神经元丢失，也不能减轻MPP+诱导的Bcl-xl下调和caspase-3上调的作用。同样，Treg细胞作用于已经沉默了SIRPA基因的神经元后，不能减轻MPP+诱导的上述所有神经毒性作用。④沉默了CD47基因后的Treg细胞不能活化神经元内的Rac1和Akt。Rac1抑制剂NSC23766预处理神经元后减弱了Treg细胞抗MPP+的神经毒性作用。同样，Treg细胞作用于已经沉默了SIRPA基因的神经元后，也不能活化神经元内的Rac1和Akt。结论1.在PD进程中，SNpc中的血脑屏障破坏，Th17细胞和Treg细胞可通过损伤的血脑屏障渗入到脑实质中。但Th17细胞功能增强，而Treg细胞功能减弱。这种Th17/Treg功能的失衡导致了神经炎症，继而产生神经毒性作用。2.Th17细胞加重MPP+诱导的DA能神经元丢失，而Treg细胞减轻MPP+诱导的DA能神经元丢失。Th17和Treg的作用一方面通过改变胶质细胞的炎症介质和营养因子的表达来实现，另一方面通过与神经元直接接触的机制而发挥。3.在与神经元直接接触的机制中，Th17细胞通过膜分子LFA-1与DA能神经元的膜分子ICAM-1的相互作用加重MPP+诱导的DA能神经元丢失；Treg细胞通过跨膜分子CD47与DA能神经元的跨膜分子SIRPA的相互作用减轻MPP+诱导的DA能神经元丢失。4.Th17细胞通过LFA-1与DA能神经元上的ICAM-1的结合启动了神经元内JNK/AP-1信号促进DA能神经元的凋亡；Treg细胞通过CD47与DA能神经元上的SIRPA的结合激活了神经元内Rac1/Akt信号抑制DA能神经元的凋亡。
【作者】刘展；
【导师】彭聿平；
【作者基本信息】苏州大学，人体解剖与组织胚胎学，2014，博士
【关键词】Th17细胞；Treg细胞；神经炎症；帕金森病；

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