通过基因敲除动物模型观察HIF-1α对糖尿病肾病的影响

【摘要】糖尿病肾病（DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，在我国，发病率仅次于高血压肾病，是引起终末期肾病（ESRD）的第二原因。糖尿病肾病的发病机制尚不十分清楚，已知与遗传、糖基化、活性氧自由基的产生、缺氧及细胞因子等众多因素有关，其中肾组织缺氧被认为是导致糖尿病肾病的最主要原因之一。有报道显示，在糖尿病发病初期，由于长时间的供氧减少及氧耗增加，肾组织处于持续性的低氧状态，是引起终末期肾病的主要原因。缺氧诱导因子（HIF-1α）在低氧反应基因的诱导中具有不可或缺的作用。它是以异二聚体形式存在的转录因子，可以与DNA特异性结合。HIF-1α对氧浓度较敏感，低氧状态下，其α亚基聚集并与HIFβ结合形成稳定、有功能的异源二聚体，启动目标靶基因的转录，以适应低氧状态。当HIF-α或β亚基缺乏时，因不能形成有活性的异二聚体而导致低氧相关基因的诱导表达受限。据文献报道，在糖尿病肾病的肾组织中HIF-1α表达水平明显上调，但HIF-1α在糖尿病肾病发生发展中的具体作用尚不明确。本实验以此为出发点，通过Cre/Loxp重组酶系统构建HIF-1α基因敲除小鼠模型，应用链脲佐菌素（STZ）注射法建立糖尿病肾病小鼠模型，探究HIF-1α对糖尿病肾病的具体作用及可能机制。目的：利用HIF-1α基因敲除小鼠动物模型，探究HIF-1α对糖尿病肾病肾组织损害的影响及可能机制。方法：利用HIF-1α基因LoxP标记小鼠和Mx-Cre转基因小鼠建立MX/HIF-1α基因敲除小鼠，应用STZ诱导MX/HIF-1α基因敲除小鼠（HIF-1α-/-组）及C57BL/6野生型小鼠（WT组）建立糖尿病小鼠模型，造模成功后观察小鼠血糖、体重变化，并记录糖尿病肾病小鼠的成模率及生存率；采用Westernblot方法观察每组小鼠肾组织内HIF-1α蛋白的表达水平，留取肾组织标本进行PAS、Masson染色观察肾组织形态学改变，并通过透射电子显微镜观察肾小球改变，造模后每周检测各组糖尿病小鼠24小时尿微量白蛋白、尿微量白蛋白尿肌酐比值（UACR）、尿白蛋白排泄率（UAER），检测各组糖尿病小鼠肾组织微循环灌注情况，并于预定时间点检测每组小鼠肾重比体重比及血肌酐、尿素氮值。结果：1．利用Cre/loxP重组酶系统构建HIF-1α基因敲除小鼠，小鼠基因型通过PCR凝胶电泳鉴定，选取Mx-Cre阳性且HIF-1α纯合LoxP标记小鼠进行干扰素诱导剂PIPC注射，以获得HIF-1α基因敲除小鼠。2．糖尿病肾病小鼠模型的建立（1）通过STZ注射，造模后小鼠血糖均≥16.7mmol/L，显著高于正常水平，糖尿病小鼠造模成功后，体重与造模前相比随时间进行性下降(P<0.05)；（2）通过肾组织PAS染色观察到造模后第10周，HIF-1α-/-组小鼠糖尿病肾病成模率达83%，而WT组糖尿病小鼠成模率为0(P<0.05)；（3）与WT组糖尿病小鼠相比，HIF-1α-/-组糖尿病小鼠生存率明显下降(P<0.05)；3．HIF-1α在糖尿病小鼠肾组织内的表达情况Westernblot结果显示WT组糖尿病小鼠在造模后第8周，HIF-1α表达明显上调，在HIF-1α-/-组糖尿病小鼠肾组织内几乎检测不到HIF-1α(P＜0.05)。4．HIF-1α-/-对糖尿病小鼠组织形态学的影响（1）肾组织PAS染色结果显示：WT组糖尿病小鼠肾小球基底膜尚且完整，未见明显增厚，间质中可见系膜基质及纤维组织轻度增多；而HIF-1α-/-组糖尿病小鼠肾小球系膜区明显增宽，系膜细胞及基质弥漫性增生，部分肾小球体积缩小(P＜0.05)。（2）肾组织Masson染色结果显示：WT组糖尿病小鼠间质中未见胶原纤维沉积；而HIF-1α-/-组糖尿病小鼠肾小球、肾小管间质内可见大量胶原纤维沉积，间质增宽伴有广泛纤维化改变(P＜0.05)。（3）电镜观察发现：WT组糖尿病小鼠足突融合较轻，排列较整齐，未见明显增宽，基底膜轻度增生，基质较均匀；而HIF-1α-/-组糖尿病小鼠足细胞突起减少，广泛融合，间隙增宽，基底膜局部厚薄不一，具有统计学意义(P＜0.05)。5．HIF-1α-/-对糖尿病小鼠肾脏生理功能的影响（1）与WT组糖尿病小鼠相比，HIF-1α-/-组糖尿病小鼠从造模后第4周开始尿微量白蛋白、UACR、UAER明显增高（P＜0.05）。（2）HIF-1α-/-组糖尿病小鼠与WT组糖尿病小鼠相比，造模8周后肾组织微循环灌注明显下降，肾重比体重比、血肌酐、尿素氮值明显增加（P＜0.05）。结论：1．通过Cre/Loxp系统成功构建HIF-1α基因敲除小鼠。2．HIF-1α敲除对糖尿病小鼠的血糖及体重变化无明显影响。3．在糖尿病小鼠肾组织内，HIF-1α表达明显增加，说明肾组织内存在缺氧状况。4．HIF-1α的缺失显著加剧糖尿病小鼠的肾组织损害，其机制可能与未能改善肾组织缺氧状态有关。
【作者】陈琪；
【导师】王医术；
【作者基本信息】吉林大学，病理学与病理生理学，2014，硕士
【关键词】糖尿病肾病；链脲佐菌素；缺氧诱导因子；

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