TRA2B调节药物成瘾信号因子RGS4的表达及其机制研究

【摘要】TRA2B(transformer2betahomolog,Drosophila)是一种SR(Serine/Arginine-richproteins)相关蛋白,主要参与调控前体mRNA剪接,从而调节基因表达。有许多证据表明TRA2B在大脑中广泛分布、参与多种脑生理功能,并与一些脑疾病相关。本论文的总目标是在本课题组以往工作基础上,进一步了解TRA2B在大脑中的可能作用。在第一部分工作中,我们用WesternBlot、免疫组织化学和免疫荧光等方法详细分析了成年大鼠脑内不同区域和核团中TRA2B的表达特征,如表达水平、核质分布、细胞类型特异性等。我们在大鼠脑内发现TRA2B蛋白有两种翻译后修饰形式,其中磷酸化形式与其细胞核分布相关联。此外,虽然TRA2B,总蛋白在大鼠脑各个组织广泛分布,但是总蛋白水平在各脑区不同,而且其磷酸化和非磷酸化状态的比例也不同,具有区域特异性。我们还发现TRA2B蛋白的免疫信号广泛存在于神经元细胞中,而在神经胶质细胞中检测不到,说明TRA2B在脑内的表达有细胞特异性。在亚细胞分布上我们还发现TRA2B蛋白在细胞核内呈斑点状分布。我们还发现TRA2B蛋白在嗅球、上丘脑、下丘脑、中脑、小脑浦肯野细胞和颗粒细胞中均有表达。尤其值得注意的是,我们观察到TRA2B在一些核团如前额叶皮层(PFC)、伏隔核(NAc)、中脑腹侧被盖区(VTA)、蓝斑区(LC)、中脑导水管周围灰质(CGD)和被盖脚桥核(RtTg)有着显著表达,这些核团都是已知的与药物成瘾及耐受有着密切联系的区域。这些结果提示了TRA2B与药物成瘾很可能有一定的联系。鉴于TRA2B是一个重要的基因表达调控蛋白,这些发现提示我们TRA2B在这些核团中可能参与某些药物成瘾相关基因表达的调控。为探索这种可能性,我们首先假设：如果TRA2B参与调控药物成瘾相关基因的表达,则TRA2B与受其调控的成瘾相关基因所表达的蛋白在脑内的空间分布应该有一定的相关性。为验证这一点,我们利用免疫荧光技术标记TRA2B蛋白,观察它与一些成瘾相关信号蛋白的共定位情况。我们观察到TRA2B与一个药物成瘾信号因子——RGS4(RegulatorofG-proteinsignaling4)在这些核团中有共分布现象。在大鼠前额叶皮层(PFC)、伏隔核(NAc)、中脑腹侧被盖区(VTA)、蓝斑(LC)这些核团中,几乎所有RGS4阳性细胞中都有TRA2B的表达。TRA2B与RGS4在空间分布上的共存现象提示了两者之间可能存在的关联。根据已有的报道,TRA2B蛋白的主要功能特征是能够结合到靶基因的前体mRNA上,与其他剪接因子构成剪接小体,并帮助识别剪接位点。因此,如果TRA2B蛋白参与调控RGS4的表达,它很有可能会结合RGS4的前体mRNA,并与构成剪接小体的其他蛋白有相互作用。通过分析TRA2B蛋白的免疫沉淀复合物,我们发现其中的确存在RGS4mRNA。同时,通过对TRA2B特异性免疫沉淀复合体的蛋白条带的质谱鉴定,我们发现了另外两个SR蛋白家族成员——ASF/SF2和SRp30c。它们很可能与TRA2B蛋白一起存在于RGS4前体mRNA的剪接小体中,并对RGS4前体mRNA剪接起调控作用。TRA2B与RGS4之间的相互结合作用提示了TRA2B对RGS4可能有调控作用。为了验证这个可能性,接着我们又从细胞水平上研究TRA2B对RGS4的表达是否有调控作用。利用细胞瞬时转染技术和RT-PCR、Westernblot分析,我们发现TRA2B过量表达使细胞内源性RGS4mRNA和蛋白水平都升高；而TRA2B表达抑制使RGS4mRNA和蛋白水平都显著降低。而且TRA2B对于RGS4水平的影响还具有浓度依赖性。说明TRA2B的确能够调控RGS4的表达。此外,我们还深入研究了TRA2B蛋白有哪些关键结构是可影响其对RGS4表达的调控功能。鉴于RS结构域(Argnine/Serine-richdomain)决定了SR蛋白的核内分布,而SR蛋白的核内分布情况又与其功能息息相关,因此我们首先通过缺失突变分析观察了TRA2B蛋白的RS1结构域及其突变体对其核内分布的影响。结果显示,TRA2B蛋白在核内speckles的定位依赖于RS1结构域而非RS2结构域,说明两个RS结构域存在差异。此外,在RS1结构域上,我们发现了多个能够引导核内speckle定位的由SR重复序列构成的特殊信号,主要集中在56-68aa、79-89aa、89-99aa这几个区段中。这些信号互相冗余,但是多个同时存在能使定位更加严格。根据文献报道,成瘾药物能够影响相关核团中RGS4的表达水平。我们以上的结果发现TRA2B在药物成瘾相关核团高表达并与RGS4共定位,并且TRA2B能够结合RGS4mRNA并调控其表达水平,即TRA2B表达增高可增加RGS4的表达,反之,使之下降。因此,我们推测：如果TRA2B参与或介导了成瘾药物刺激引起的RGS4表达变化,那么在成瘾情况下,成瘾相关核团中的TRA2B和RGS4的表达水平变化也有类似的相关性。为了验证这一推测,我们研究了成瘾药物——吗啡刺激对TRA2B的影响。结果发现,与注射生理盐水的对照组相比,急性吗啡刺激使大鼠蓝斑区中TRA2B和RGS4蛋白含量降低,而慢性吗啡刺激使大鼠蓝斑区TRA2B和RGS4蛋白含量升高,阿片受体拮抗剂纳洛酮可以抑制由吗啡刺激引起的TRA2B和RGS4蛋白表达量的变化。这种变化的一致性提示TRA2B很有可能作为调控RGS4表达的上游基因参与成瘾药物刺激引起的RGS4蛋白水平变化,即通过调控RGS4表达而参与药物成瘾过程。综上所述,我们的工作围绕着TRA2B调控药物成瘾相关因子RGS4的表达及其机制这一方向,进行了一些研究,发现了在药物成瘾相关核团中TRA2B和RGS4蛋白的共分布,在细胞模型中证明了TRA2B对RGS4的调控作用,并从TRA2B蛋白结构方面研究了此种调控作用的机制。此外,这种细胞模型中观察到的TRA2B对RGS4的调控作用所呈现的TRA2B和RGS4蛋白变化的相关性也存在着于成瘾药物刺激下的大鼠脑内的成瘾相关核团中。这些结果提示,作为一个在大脑中具有复杂功能的剪接调节因子,TRA2B很有可能通过调节药物成瘾相关因子RGS4基因的表达,参与到药物成瘾信号通路中。
【作者】李舒婧；
【导师】徐平；
【作者基本信息】复旦大学，神经生物学，2011，博士
【关键词】TRA2B蛋白；组织特异性；细胞特异性；药物成瘾相关核团；RGS4；免疫沉淀；剪接小体；TRA2B；RGS4mRNA；ASF/SF2；SRp30c；表达调控；nuclearspeckles定位；急性吗啡刺激；慢性吗啡刺激；纳洛酮；

【参考文献】
[1]杨洪山,何跃,陈家训.基于网格和多Agent的电子政务协同工作系统[J].计算机应用研究,2004,10:209-211+214.
[2]陈学敏.论我国《预算法》的修改[D].吉林大学,法律,2013,硕士.
[3]邓晓东.核心蛋白聚糖及相关炎症因子在血管痉挛患者中浓度的动态变化及临床意义[D].第二军医大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[4]陈星亚.车载Ad hoc网络路由协议研究[D].西南交通大学,计算机技术,2012,硕士.
[5]张珩,疏松桂.基于边界建模的鲁棒控制方法[J].自动化学报,1991,05:545-550+638.
[6]杨春.国邦美家居建材卖场的发展对策研究[D].安徽大学,工商管理,2013,硕士.
[7]马梦璐.张天翼现代童话的喜剧品质研究[D].沈阳师范大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[8]田亦娟.古代雅典竞技发展与民主演进的互动关系研究[D].山西师范大学,世界史,2014,硕士.
[9]王晓峻,吴鹏,王志坚.基于三角网的等值线生成及ActiveX实现[J].长江科学院院报,2001,04:51-53.
[10]刘贺.移动网络接入认证的隐私保护研究[D].北京交通大学,信号与信息处理,2014,博士.
[11]占小波.Pdx1激活Ngn3和Pax6诱导iPS细胞向胰岛β细胞分化的作用及其机制研究[D].广州医科大学,外科学,2014,硕士.
[12]王清刚.2012年度上海广富林遗址山东大学发掘区发掘报告[D].山东大学,文物与博物馆学（专业学位）,2013,硕士.
[13]谢峰,刘婷婷,杨果,袁静,孔小林,许天明,谭成侠.新型1H-吡唑-4-甲酰胺类衍生物的合成及杀螨活性[J].有机化学,2013,12:2596-2601.
[14]卢峰.海洋环境下混凝土硫酸盐腐蚀研究[D].青岛理工大学,结构工程,2012,硕士.
[15]马博强.污泥堆肥用于林木及草坪草种植时重金属的迁移与分布研究[D].北京林业大学,环境科学,2013,硕士.
[16]张小英.基于广义功能建模的复杂产品模块化设计技术研究[D].西南交通大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[17]李文广.论民事判决既判力客观范围的扩张[D].黑龙江大学,诉讼法学,2013,硕士.
[18]杭开武.板坯库计算机控制和管理[J].冶金自动化,2007,05:14-17+33.
[19]颜宏文,马瑞,龙际珍,颜宏斌.数据挖掘中判定树算法SLIQ的设计与应用[J].计算机工程,2005,06:60-62.
[20]仲维亮.基于IP over RapidIO的DDS中间件优化实现[D].西南交通大学,计算机系统结构,2013,硕士.
[21]张喆.视频监控下的行人数量统计研究[D].郑州大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[22]段先文.基于DM368的地铁语音系统控制器硬件设计与实现[D].大连理工大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[23]方福来.中国零售业研究—沃尔玛案例分析[D].东北财经大学,国际贸易学,2003,硕士.
[24]杨华伟.乳腺癌患者外周血Hmam-mRNA的检测及其临床意义[D].广西医科大学,肿瘤学,2004,硕士.
[25]侯宇红.杭州市滨江大道居住社区空间营造研究[D].浙江大学,城市规划与设计,2004,硕士.
[26]盛斌.内窥镜配合下经椎弓根通道治疗胸腰椎结核的解剖学观察及临床可行性研究[D].桂林医学院,外科学,2012,硕士.
[27]王永莲.一汽轿车人力资本对企业净利润贡献率的研究[D].吉林大学,工商管理,2013,硕士.
[28]邹宇曦.对大学英语立体化教材使用情况的思考[D].上海外国语大学,英语语言文学,2012,硕士.
[29]支晓兰.阿尔及利亚市民社会研究[D].西北大学,世界史,2013,硕士.
[30]孟昕.住房公积金联网审计管理系统的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[31]孙丽媛.一腔禅意任平生[D].黑龙江大学,中国现当代文学,2013,硕士.
[32]孙奎.农民工返乡创业现状及对策研究[D].华中师范大学,农村与区域发展,2013,硕士.
[33]张喻.论楚辞《九歌》中的自然崇拜[D].华中师范大学,古代文学,2014,硕士.
[34]江春媛.论“9·11小说”中对穆斯林男性的他者化[D].上海大学,英语语言文学,2014,硕士.
[35]邹智慧.长春市中小企业员工福利现状、问题及对策研究[D].长春工业大学,社会保障,2013,硕士.
[36]贾红伟,刘红梅.可编程序控制器在飞剪控制系统上的应用[J].冶金自动化,2003,01:71.
[37]林清标.论我国强制拍卖制度之完善[D].华侨大学,法律,2013,硕士.
[38]杨刚,赵红,石强.基于移动代理的MIDS研究与设计[J].河北大学学报(自然科学版),2005,04:439-442.
[39]丁文静.中美高中主流生物教材实验部分的比较研究[D].东北师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[40]徐建琴.思想政治工作在市场经济建设中的地位和作用研究[D].淮北师范大学,思想政治教育,2014,硕士.
[41]马越.试论北魏法律儒家化的进程[D].郑州大学,中国古代史,2013,硕士.
[42]杨晓红.成仿吾与创造社[D].河北师范大学,中国现当代文学,2012,硕士.
[43]张翠莲.C高校内部控制研究[D].长安大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[44]闫芳芳.城乡小学教师的职业压力、社会支持与职业倦怠的关系研究[D].华中师范大学,应用心理,2014,硕士.
[45]吴磊.基于社会网络分析的微博用户研究[D].安徽大学,管理学,2014,硕士.
[46]温新才.意象文字与图形的关联性设计研究[D].西南交通大学,艺术设计,2014,硕士.
[47]孙琳.铌锌—铌锡—锑锰—锆钛酸铅系压电陶瓷组成和性能的研究[D].天津大学,材料学,2004,硕士.
[48]张晓娟.美国终身教职制度对我国教师聘任制改革的启示[D].鲁东大学,教育学原理,2014,硕士.
[49]张慧洁.多属性决策在武汉南岸嘴及龟北片工业遗产价值评价中的应用研究[D].华中农业大学,园林植物与观赏园艺,2014,硕士.
[50]姚日鹏.《软饮料制造废水治理工程技术规范》编制研究[D].山东建筑大学,建筑与土木工程（专业学位）,2013,硕士.