钙调神经磷酸酶在压力超负荷致左室舒张功能不全中的作用机制研究

【摘要】舒张性心力衰竭(也称射血分数保留的心力衰竭)是目前基础和临床研究的热点,因其在发病机理和临床特点等方面有别于收缩性心力衰竭,好发于伴有高血压、糖尿病的人群及老年女性人群。而左室舒张功能不全是舒张性心力衰竭的最早期表现,其特点为心室舒张延迟和/或顺应性减低。关于正常心脏如何在损伤因子作用下发展到舒张功能不全以及如何由舒张功能不全进展到舒张性心力衰竭,目前研究较少,一方面是由于缺乏公认的舒张功能不全的动物模型,另一方面也在于舒张性心力衰竭的概念近年才受到重视。和收缩性心力衰竭的治疗能够有效逆转和/或延缓左室重构不同,舒张性心力衰竭的处理目前主要以治疗和纠正原发病为主(2012年欧洲急慢性心力衰竭治疗指南),拮抗神经内分泌激活在收缩性心力衰竭患者能显著降低心衰住院率和死亡率,而在舒张性心力衰竭患者目前尚没有临床研究证实其效益。钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)及其信号通路被证实在高血压心肌肥厚的病理性心脏重构过程中发挥重要作用,而高血压也是引起舒张功能不全和舒张性心力衰竭最常见的原因。那么钙调神经磷酸酶信号通路在压力超负荷条件下对在心脏重构过程中发挥重要作用的心肌细胞和心脏成纤维细胞的作用机制如何还未完全明确。笔者进行了一项荟萃分析结果显示舒张性心力衰竭患者长期应用ACEI类药物可以降低全因死亡率,却未能降低心衰死亡率和全因再入院率,因此,对于舒张性心力衰竭尤其是早期舒张功能不全的识别和机制研究,有助于对此类患者的早期干预和改善预后。本研究首先拟选择舒张功能不全的代表性动物模型,进行评价,然后从分子机制水平,以心肌细胞和心脏成纤维细胞为主要研究对象以期初步阐明钙调神经磷酸酶在压力超负荷致左室舒张功能不全中的作用,最后通过动物水平药物干预的效果和机制探讨,从而明确钙调神经磷酸酶在压力超负荷引起的左室舒张功能障碍过程中的作用机理,为临床预防和治疗左室舒张功能不全和舒张性心力衰竭提供理论依据和干预靶点。第一部分压力超负荷致左室舒张功能不全动物模型的观察和评价目的：采用超声心动图评价自发性高血压大鼠左室舒张功能变化。方法：3月龄雄性SHR和Wistar大鼠各15只,观察时间点分别为3月龄、6月龄和9月龄(n均等于5)。采用17.5MHz小动物高频超声探头,通过M型超声、二尖瓣口血流频谱多普勒和二尖瓣环组织多普勒技术,评价两组大鼠心脏结构与舒张功能各项指标变化,并检测血清NT-proBNP水平以及通过组织病理学观察两组大鼠心脏病理改变。结果：和Wistar大鼠相比,3月龄SHR收缩压明显升高(168.0±4.5mmHgvs105.8±8.4mmHg,P<0.01),血清NT-proBNP水平高于同月龄Wistar大鼠(284.38±6.54finol/mlvs190.77±15.47finol/ml,P<0.01),超声显示SHR室间隔厚度(IVS)、左室后壁厚度(LVPW)均大于Wistar大鼠(IVS:1.58±0.08mmvs1.16±0.13mm,P<0.01;LVPW:1.65±0.08mmvs1.39±0.18mm,P<0.01),E/E’升高(26.28±1.76vs18.85±3.69,P<0.01);6月龄和9月龄SHRE/A、E’/A’均小于同月龄Wistar大鼠值(6月龄E/A:2.05±0.23vs2.78±0.14,E’/A’:0.57±0.06vs1.46±0.10；9月龄E/A:1.92±0.13vs2.67±0.31;E’/A’:0.61±0.07vs1.44±0.11;所有P<0.05),NT-proBNP水平均高于Wistar大鼠值(6月龄：333.40±13.42fmol/mlvs191.42±8.25fmol/ml;9月龄：354.31±9.39fmol/mlvs190.36±9.13fmol/ml;所有P<0.01),E/E’均大于同月龄Wistar大鼠值(6月龄：30.85±1.35vs21.08±1.64；9月龄：31.77±5.22vs21.54±2.11,所有P<0.01)；减速时间(DT)等容舒张时间(IVRT)两组大鼠比较差异无统计学意义。6月龄和9月龄SHRE/A、E’/A’均小于3月龄SHR值(P<0.05)；E/E’均大于3月龄SHR值(P<0.05)；DT、IVRT比较差异无统计学意义。不同月龄Wistar大鼠各项舒张功能超声指标变化差异无统计学意义。SHR和Wistar大鼠随月龄增大收缩功能变化差异均无统计学意义。心肌组织HE染色显示,和Wistar大鼠相比,随SHR月龄增大,心肌细胞进行性肥大；Masson染色观察胶原含量变化表明随着舒张功能进行性受损,SHR心肌间质及血管周围胶原显著增多。结论：6月龄自发性高血压大鼠出现舒张功能异常,组织学主要表现为心肌细胞肥大和间质及血管周围纤维化,高频超声是评价心脏结构和舒张功能的良好手段。第二部分钙调神经磷酸酶在牵张的心肌细胞肥厚和凋亡中的作用探讨目的：明确钙调神经磷酸酶对牵张后的心肌细胞肥厚和凋亡的影响及作用机制。方法：酶消化+差速贴壁的方法培养SD乳鼠原代心肌细胞,机械牵张模拟压力超负荷条件,将培养的细胞随机分为对照组、机械牵张组、钙调神经磷酸酶siRNA+机械牵张组、FK506+机械牵张组、钙调神经磷酸酶过表达+机械牵张组。收集细胞提取总蛋白和mRNA检测细胞肥大(ANP、SAA)和凋亡(Bax/Bcl-2)相关指标表达及活性改变。结果：钙调神经磷酸酶干扰和过表达慢病毒载体构建成功,转染效果确定。和对照组相比,单纯牵张导致明显的细胞肥大和凋亡增加,过表达钙调神经磷酸酶后产生和牵张类似的效应,而钙调神经磷酸酶干扰以及FK506抑制钙调神经磷酸酶活性后以上负性作用明显减轻,钙调神经磷酸酶干扰的改善作用更明显。伴随钙调神经磷酸酶活性的上调/下调,其下游信号分子NFAT3对应表达上调/下调。结论：钙调神经磷酸酶参与了机械牵张模拟压力超负荷条件刺激下的心肌细胞肥大和凋亡过程,阻断Calcineurin/NFAT3信号通路可以逆转心肌肥大和减轻细胞凋亡。第三部分钙调神经磷酸酶在牵张心脏成纤维细胞增殖、转分化和凋亡中的作用机制探讨目的：明确钙调神经磷酸酶对牵张后的心脏成纤维细胞增殖、转分化和凋亡的影响及作用机制。方法：酶消化法培养SD乳鼠原代心脏成纤维细胞,消化传代取P2～P3代细胞,机械牵张模拟压力超负荷条件,将培养的细胞随机分为对照组、机械牵张组、钙调神经磷酸酶siRNA+机械牵张组、FK506+机械牵张组、钙调神经磷酸酶过表达+机械牵张组。采用CCK-8法和WB检测细胞增殖(PCNA)、WB检测转分化(α-SMA)和凋亡(Bax/Bcl-2)相关指标的变化。同时通过TGF-β1刺激培养的心脏成纤维细胞,探讨钙调神经磷酸酶通路在增殖和转分化中所发挥的作用。结果：CCK-8细胞活性检测和免疫印迹检测PCNA结果显示,和对照组相比,单纯牵张引起显著的成纤维细胞过度增殖,过表达钙调神经磷酸酶后产生和牵张类似的效应,同时,钙调神经磷酸酶信号通路的激活促使心脏成纤维细胞转分化和凋亡增加,而钙调神经磷酸酶干扰后心脏成纤维细胞增殖被抑制,转分化和凋亡减少。不同的是,FK506抑制钙调神经磷酸酶活性后心脏成纤维细胞增殖和凋亡有所减轻,转分化未见明显减少。同时我们发现,TGF-β1刺激后的心脏成纤维细胞增殖和转分化增加伴随有Calcineurin/NFAT3信号通路的激活。结论：钙调神经磷酸酶参与了机械牵张模拟压力超负荷条件刺激下的心脏成纤维细胞增殖、转分化和凋亡过程,阻断Calcineurin/NFAT3信号通路可以逆转以上负性重构过程。第四部分奥美沙坦通过抑制钙调神经磷酸酶信号通路逆转左室舒张功能不全的实验研究目的：探讨奥美沙坦能否通过下调钙调神经磷酸酶信号通路而逆转左室舒张功能不全。方法：采用已经明确出现舒张功能不全的6月龄SHR,随机分为SHR+saline组和SHR+olmesartan组(n均等于12),同时以6月龄Wistar大鼠+saline作为对照组,相应给予10ml/kg/d的生理盐水或者2.5mg/kg/d的奥美沙坦灌胃3个月。于基线情况下及干预后超声检测心脏舒张功能,心脏组织HE染色和RealtimePCR观察心肌肥厚变化,Masson三色染色观察心肌间质胶原沉积,免疫印迹观察钙调神经磷酸酶/NFAT3信号通路蛋白表达变化。结果：舒张功能不全伴随钙调神经磷酸酶信号通路的过度激活,而奥美沙坦能够下调该病理性信号通路。结论：奥美沙坦通过下调Calcineurin/NFAT3信号通路而起到改善压力超负荷致左室舒张功能不全的作用。
【作者】付明强；
【导师】钱菊英；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】高频；超声心动描记术；自发性高血压大鼠；舒张功能；钙调神经磷酸酶；心肌细胞；肥大；凋亡；心脏成纤维细胞；增殖；转分化；奥美沙坦；左室舒张功能；

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